不同浓度硒含量的富硒乳酸菌抑制黄曲霉菌生长以及产毒效果的研究

姚婉，赵方红，刘丽娜，秦顺义

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津西青区300384）

不同浓度硒含量的富硒乳酸菌抑制黄曲霉菌生长以及产毒效果的研究

姚婉，赵方红，刘丽娜，秦顺义*

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津西青区300384）

为研究不同浓度硒含量的乳酸菌对黄曲霉菌生长及产毒的抑制效果，测定了硒浓度分别为10、15、20、25 μg/mL的MRS液体培养基中培养的乳酸菌对黄曲霉菌落生长抑制率、黄曲霉孢子生长抑制率以及黄曲霉产毒量抑制效果。结果显示：硒浓度在10～25 μg/mL，培养48 h的富硒乳酸菌对于黄曲霉生长的抑制率较乳酸菌组增长了0.6%～9.4%，96 h抑制率达到了37.1%；培养6 h的黄曲霉孢子生长抑制率较乳酸菌组增长了0.2%～61%，24 h抑制率达到93.6%；产黄曲霉毒素B1抑制率较乳酸菌组提高10.3%～56.6%，24 h抑制率达到了97.3%。硒浓度达到25 μg/mL的富硒乳酸菌对于黄曲霉生长的抑制率、黄曲霉孢子生长抑制率和产黄曲霉毒素B1抑制率均达到最大。结果提示，富硒乳酸菌对于黄曲霉菌落的生长、孢子萌发以及黄曲霉毒素的产生都有一定程度抑制作用，并且硒浓度达到25 μg/mL，抑制效果最好。

乳酸菌；黄曲霉菌；生长抑制率；孢子；富硒乳酸菌；黄曲霉毒素B1

黄曲霉可对饲料造成严重污染，其产生的毒素中黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最强，是氟化钾的10倍，砒霜的68倍，会对机体造成致畸、致癌、致突变的危害（冯建蕾，2005），并能降低机体的免疫力，造成肝脏的损伤甚至死亡。目前黄曲霉毒素的去毒方法有物理、化学方法和生物学方法。利用物理方法和化学方法在一定程度上可以减少黄曲霉毒素B1对人类造成的危害，但这些方法均存在安全性及食品营养损失等问题。生物学方法是利用微生物吸附毒素和降解代谢产物，具有安全、高效、无二次污染的特点（王宏祥，2014）。研究表明乳酸菌对于黄曲霉毒素B1有一定的吸附作用，但并不能完全去除AFB1，主要是对其进行吸附脱毒，降解率不高（EL-Nezami等，1998）。Eraslan等（2005）研究发现，将乳酸菌添加到培养基中可显著抑制曲霉菌丝的生长和毒素形成。有机硒也可以有效拮抗黄曲霉毒素B1的毒性，从而缓解其对机体造成的损害。无机硒对机体有一定的毒性，乳酸菌具有将有毒性的无机硒转化为无毒的有机硒的特性，结合形成的富硒乳酸菌对于黄曲霉毒素B1的吸附和拮抗效果更好，对于黄曲霉的生长也起到有效的抑制作用。本试验选取硒浓度分别为10、15、20、25 μg/mL，主要对黄曲霉生长抑制率、黄曲霉孢子生长抑制率和黄曲霉产毒量抑制效果进行比较，并找到对黄曲霉抑制效果最佳的硒浓度的富硒乳酸菌。

1　材料与方法

1.1试验材料产毒黄曲霉CGMCC 3.4410，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；乳酸菌株，实验室保存。

察氏琼脂培养基（北京索莱宝科技有限公司）；PDA琼脂培养基（北京索莱宝科技有限公司）；产毒培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）。

MRS液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，七水硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水定容1000 mL，pH 6.8，121℃高压灭菌15 min，分装，待用。

MRS固体培养基：MRS液体培养基加1.5%的琼脂，121℃高压灭菌15 min，冷却后倒入平板内置于4℃冰箱内待用。亚硒酸钠贮备液：精确称取亚硒酸钠0.0218 g，溶于蒸馏水，然后定容至100 mL，所得溶液的硒浓度为100 μg/mL（以硒计）。

亚硒酸钠（合肥博美生物科技有限责任公司）、丙三醇（天津市北辰方正试剂厂）、磷酸盐缓冲液［含0.05%吐温-80（V/V）］、AFB1检测试剂盒（Beacon公司）、乳酸（天津市北辰方正试剂厂）。

1.2试验方法

1.2.1富硒乳酸菌的制备将1%的乳酸菌种子液分别接种到含有亚硒酸钠溶液的MRS液体培养基中，硒浓度分别为10、15、20、25μg/mL，37℃、120rmp培养48 h。将乳酸菌浓度调整到1×109cfu/mL。

1.2.2孢子悬液的制备将活化的黄曲霉菌接种在PDA斜面培养基，28℃培养5～10 d后，加入一定量的磷酸盐缓冲液（含0.05%吐温-80），用接种环挑取斜面上的孢子到缓冲液中，然后将含有霉菌孢子的磷酸盐缓冲溶液通过无菌纱布过滤以除去菌丝残体。用磷酸盐缓冲溶液将孢子浓度调整到1×107cfu/mL，待用。

1.2.3对黄曲霉菌生长的影响分别用四种不同浓度硒含量富硒乳酸菌菌液、不含硒乳酸菌全菌液各1 mL分别涂布在7个PDA培养基上，待液体完全吸收后，在培养基的中心接种20 μL黄曲霉孢子悬液（1×107cfu/mL），同时设未涂布乳酸杆菌的空白PDA培养基为空白对照组，接种20 μL黄曲霉孢子悬液，28℃培养，分别对培养48、72、96 h菌落大小进行测量，计算乳酸菌对霉菌生长的抑制率。

每组设3个重复，各试验重复3次，以3次试验结果平均值进行分析。

1.2.4对黄曲霉孢子生长数量的影响处理组：将500 μL的黄曲霉胞子液（1×107cfu/mL）分别加入到5 mL四个不同浓度的富硒乳酸菌菌液（1× 109cfu/mL）、不含硒乳酸菌全菌液中。

空白对照组：将500 μL黄曲霉孢子悬液接种到空白的MRS液体培养基中，不调pH值。处理组和空白对照组均在28℃培养，分别于6、18、24 h取不同处理组0.1 mL涂布PDA平板，28℃培养5 d，进行孢子计数，计算处理组和对照组1的抑制率，计算公式为：

各组均设3个重复，各试验重复3次，以3次试验结果平均值进行分析。

1.2.5对黄曲霉产毒量的影响在63.34 g甘油中加入1L水，配成甘油水溶液，主要作用是保持培养基的湿度，将产毒培养基灭菌后分装在培养皿中，每个培养皿均匀喷洒灭菌过的2 mL甘油水溶液待用。用黄曲霉孢子数量影响试验中的处理组胞子悬液分别于6、18、24 h取100 μL悬液点植接种在培养基正中央，同时设空白对照组：在5 mL无菌生理盐水中加入500 μL黄曲霉孢子悬液，吸取100 μL悬液，同样的方法点植接种在培养基正中央，35℃培养16～17 d。每组设3个重复组，各试验重复3次，以3次试验结果平均值进行分析。

AFB1的提取：将培养皿黄曲霉连同培养基一同放入烧杯中。在烧杯中加入1gNaCl，加入10 mL甲醇-水提取液（V/V=1∶1），用玻璃棒搅拌，超声萃取10 min后，用玻璃纤维滤纸过滤，取上滤液，用AFB1检测试剂盒进行检测。

2　结果与分析

2.1黄曲霉生长抑制试验结果从表1的结果可见，在48 h时，四个试验组黄曲霉菌落的生长抑制率较乳酸菌对照组增长0.6%～9.5%，且随着培养时间的延长，对黄曲霉菌落生长的抑制效果有所增加，到96 h硒浓度为25 μg/mL的试验组黄曲霉霉菌落生长抑制率达到了37.1%。

表1　黄曲霉菌落生长抑制效果%

2.2黄曲霉孢子萌发数量抑制试验结果从表2可以看出，乳酸菌对照组和四个试验组对孢子的萌发均起到了抑制的作用，在6 h时，硒浓度为20、25 μg/mL的试验组较乳酸菌对照组增长了39.1%、61%；在18 h时，硒浓度为15、20、25 μg/mL的试验组的抑制率均达到了60%以上；24 h抑制率均有所增长，硒浓度为25 μg/mL组抑制率达到了94.6%。

表2　黄曲霉孢子萌发数量抑制效果%

2.3黄曲霉产毒抑制试验从表3的试验结果可见，6 h时四个试验组黄曲霉菌落生长抑制率较乳酸菌对照组增长10.3%～56.6%，硒浓度为20、25 μg/mL组对于黄曲霉产毒的抑制率分别增长32.2%和56.6%，且随培养时间的延长，抑制率都有一定程度的增长，在18 h以及24 h时，硒浓度25 μg/mL组的抑制率超过90%。

3　讨论

动物食入被黄曲霉毒素污染的饲料后，导致采食量下降，日增重缓慢，饲料利用率下降。经研究发现1 mg/kg含量的AFB1就可以造成畜禽体重、产蛋率、产奶率、饲料利用率等生产指标下降（刘玫珊，1994）。饲料中黄曲霉毒素含量越多，对动物生产性能损害越大，当黄曲霉毒素浓度达到动物耐受极值时，慢性作用转化为急性作用，直接导致死亡（Schell等，1993）。预防黄曲霉毒素对食品污染的最有效手段是控制产毒素霉菌的生长，有效控制黄曲霉产毒量，经研究发现乳酸菌对黄曲霉生长和孢子萌发以及产毒效果均有一定的抑制作用（徐进等，2001）。

表3　黄曲霉产毒抑制效果%

乳酸菌对于黄曲霉生长及其产毒量抑制效果的相关研究较多，但未见富硒乳酸菌吸附黄曲霉毒素的研究。在富硒乳酸菌对黄曲霉菌落生长抑制试验中发现乳酸菌组以及4个不同硒浓度的试验组对于黄曲霉菌落生长均可起到一定的抑制作用，但是抑制率较低，可能是由于所选用的乳酸菌传代次数过多，培养出来的乳酸菌的表面性质或者表面结构产生变化。

本试验结果表明，富硒乳酸菌对于黄曲霉抑制效果优于乳酸菌的效果，随着硒浓度的增大，富硒乳酸菌对于黄曲霉生长的抑制率、黄曲霉胞子生长抑制率和黄曲霉毒素B1产生抑制率有所增大，并且随着时间的延长抑制效果有所增加，硒浓度达到25 μg/mL的富硒乳酸菌对于黄曲霉生长的抑制率、黄曲霉孢子生长抑制率和黄曲霉毒素B1产生抑制率达到最大。

4　结论

黄曲霉及其产生的毒素可污染粮食作物及饲料，从而影响畜禽的生产繁殖以及人类健康，因而从源头控制或减少黄曲霉的生长及产毒意义重大。本试验研究表明，富硒乳酸菌能够抑制黄曲霉生长、胞子萌发以及产毒量，硒浓度达到25 μg/mL时抑制效果最好。富硒乳酸菌无毒无害，且具有一定的保健功效，因此，可用于控制黄曲霉毒素污染，从而减少黄曲霉对人类造成的危害。

［1］冯建蕾.黄曲毒素的危宙危害和防治［J］.中国畜牧兽医，2005，32（12）：5～7.

［2］刘玫珊.含硫氨基酸对黄曲霉毒素B的解毒机理［J］.中国兽医科技. 1994，11：6～9.

［3］王宏祥.富硒乳酸菌拮抗黄曲霉毒素对肉仔鸡毒性作用的研究：［硕士学位论文］.天津［D］：天津农学院，2014.

［4］徐进，李玉伟，计融，等.乳杆菌及不同pH值对黄曲霉生长与产毒的影响［J］.中国食品卫生杂志.2001，13（6）：3～6.

［5］El-Nezami H，Kankaanpaa P，S，et al.Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind a common food carcinogen，aflatoxin B1［J］.Food and Chemical Toxicology，1998，36（4）：321～326.

［6］Eraslan G，Akdogan M，Yarsan E，et al.The effects of aflatoxin on oxidative stress in broiler chicks［J］.Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences，2005，29：701～707.

［7］Schell Tc，Lindemann M D KET，Blodgett D J.Effects of feeding Aflatoxin-contaminated diets with and without clay to weanling and growing pigs on performance，liver function，and mineral metabolism［J］.J Anim Sci，1993，71：1209～1218.

To study inhibitory effect of different concentrations selenium content in se-enriched lactobacillus on the growth and toxin-producing effect of Asporgillus，we determined the effect of Aspergillus colony，flavus and toxin production’s growth inhibition rate by Lactobacillus，cultured in MRS liquid medium with 10，15，20，25 μg/mL.The results showed that inhibition ratio of Aspergillus growth effected by se-enriched Lactobacillus cultured in 10～25 μg/mL sodium selenite concentration for 48 h increased by 0.6%～9.4%and inhibition ratio reached to 37.1%for 96 h，inhibition ratio of Aspergillus flavus for 6 h increased by 0.2%～61%compared with lactic acid bacteria group and inhibition ratio reached to 93.6%for 24 h.The growth inhibition rate of aflatoxin B1production increased by 10.3%～56.6%compared with lactic acid bacteria group and inhibition ratio reached to 97.3%for 24 h.The growth inhibition rate of Aspergillus colony，flavus and aflatoxin production B1reached the maximum under the lactic acid bacteria containing 25 μg/mL selenium concentration.These results suggested that se-enriched Lactobacillus presented some inhibition to the growth of Aspergillus flavus coenobium，spore germination and the production of aflatoxin，inhibitory effect was the best when the concentration of Se reached 25 μg/mL.

lactobacillus；aspergillus flavus；growth inhibition ratio；spore；Se-enriched lactobacillus；aflatoxin B1

S816.3

A

1004-3314（2016）12-0019-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161205

国家自然科学基金项目（31101867）；天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（15JCYBJC30600）