苜蓿粉发酵用乳酸菌的筛选及特性研究

杨慧晓，王雁萍，郭琳娜，赵珊珊，杨逢源

（河南省离子束生物工程省重点实验室，河南郑州450052）

资源开发利用

苜蓿粉发酵用乳酸菌的筛选及特性研究

杨慧晓，王雁萍*，郭琳娜，赵珊珊，杨逢源

（河南省离子束生物工程省重点实验室，河南郑州450052）

为筛选调制优质动物苜蓿青贮饲料的优良乳酸菌，本试验以从郑州地区9个苜蓿样品中分离得到的乳酸菌为试验材料，经抗菌活性、生长特性及产酸特性筛选菌株，根据16S rDNA序列，结合生理生化特征进行菌种鉴定，并通过发酵苜蓿粉考察菌株的发酵特性。结果表明，从分离的19株乳酸菌中筛选到4株具有高抗菌活性的菌株，其中菌株ZZU 457和ZZU 466在MRS液体培养基中生长及产酸性能较好，均能够耐受6.5%的盐浓度环境；菌株ZZU 457耐受10～45℃，以及pH为3.5的环境，而菌株ZZU 466能够耐受5～50℃，以及pH为4.0的环境；苜蓿粉发酵结果表明接种ZZU 457或ZZU 466在发酵18 h内均能快速产酸，其中接种ZZU 466的苜蓿粉发酵36 h时pH值达到4.2；结合理化特征及16S rRNA序列分析结果，ZZU 466被鉴定为融合魏斯氏菌。优良菌株ZZU 466在苜蓿青贮饲料调制加工中具有潜在的应用价值。

苜蓿粉；发酵；乳酸菌；筛选；特性

苜蓿作为一种优质豆科饲草，其蛋白质含量高，且营养成分丰富，对奶牛饲喂和肉牛增重方面效果显著。在我国主要苜蓿种植区，由于雨淋、落叶等因素引起的损失高达30%，将其进行青贮可明显避免这些损失，且能促进家畜对其消化（王永新等，2012）。然而刈割期的苜蓿由于缓冲度高、可溶性糖分低及表面自然附着的乳酸菌较少等特征使其青贮较难（李改英等，2010）。相关研究表明，使用优良乳酸菌作为青贮添加剂，对改善苜蓿青贮饲料品质有显著效果（许庆方，2005）。本研究从郑州地区苜蓿自然附生乳酸菌中筛选适合苜蓿粉发酵的优良菌株，以期为开发用以调制优质动物苜蓿青贮饲料的乳酸菌添加剂提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1材料新鲜的紫花苜蓿（取自郑州地区）自然晾干后于65℃烘箱烘48 h，用高速粉碎机制成粉末，过40目筛并置于4℃冰箱中保存备用。

1.1.2培养基MRS液体培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 L，pH 6.5。

NA培养基（用于沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌的培养）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2。

半固体培养基：配方同NA培养基，琼脂含量为0.8%。

1.1.3仪器设备722型可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；台式酸度计（奥豪斯）；PTC-200 PCR仪；GelDoc-XR凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司。

1.2试验方法

1.2.1乳酸菌的分离和纯化将新鲜苜蓿样品切成小块，取10 g样品加入90 mL无菌水中，摇匀即为稀释10倍的样品悬液，按照10-6～10-2的梯度进行稀释，取适当浓度菌液20 μL涂布在固体MRS平板上，置于30℃厌氧培养箱中，培养48 h后计数，并挑选典型菌落分离纯化直到经革兰氏染色为阳性、镜检结果为单纯菌株时再进行过氧化氢酶试验。凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株即可初步确定为乳酸菌，将其接种到MRS固体斜面上，4℃冰箱中保存备用。

1.2.2无细胞上清液的制备将纯化的19株乳酸菌，按2%的接种量分别接种于1 mL MRS液体培养基中，30℃条件下培养48 h后，4℃、12000 g离心（10 min）获得上清液，并用0.22 μm微孔滤膜过滤得到无细胞发酵上清液。

1.2.3抑菌活性测定选取大肠杆菌、沙门氏菌及单核增生李斯特菌作为指示菌，采用双层牛津杯抑菌法对19株乳酸菌进行抑菌筛选。取10 mL指示菌菌悬液（浓度约106～107cfu/mL）均匀涂布于NA半固体平板上，牛津杯放置在上层指示菌培养基上。加入200 μL发酵上清液于牛津杯，37℃培养恒温培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。

1.2.4生理生化、产酸特性测定及生长曲线绘制通过形态、革兰氏染色、过氧化氢酶等试验及设置不同的温度、pH和盐浓度条件分析乳酸菌的生理生化特性，生长特性及产酸特性。均按2%的接种量将筛选菌株的菌液接种到100 mL液体MRS培养基中，每2 h取样测定pH值及波长为600 nm处的吸光度值，并分别将不同时间的pH值及OD值绘制成产酸曲线和生长曲线（Pang等，2011）。

1.2.5苜蓿粉的发酵特性将经抗菌活性、生长特性及产酸特性筛选的乳酸菌接种到40%的苜蓿粉浆中，每隔6 h取样1 g，加9 mL蒸馏水，充分混匀，测定pH值，并绘制产酸曲线。

1.2.616s rDNA序列测定通过CLUSTAL W软件将菌株的16S rDNA序列与在GenBank中检测得到的标准菌株序列信息进行比对，采用邻接法构建系统发育树，并用枯草芽孢杆菌Bacillus. subtilis作外围菌株（Ni等，2015）。

2　结果与分析

2.1高抗菌活性乳酸菌的筛选从郑州地区的9个苜蓿样品中，分离到19株乳酸菌。通过对三种指示菌的抑菌试验，筛选到4株高抗菌活性的乳酸菌。由表1可见，菌株ZZU 456、ZZU 457和ZZU 473对大肠杆菌的抑菌活性均较高；菌株ZZU 457、ZZU 466和ZZU 473对李斯特菌的抑菌活性均较高；菌株ZZU456、ZZU 457和ZZU 466对沙门氏菌的抑菌活性均较高。

表1　筛选菌株的抑菌活性

2.2生长特性筛选得到的4株高抗菌活性乳酸菌在MRS液体培养基中的生长曲线见图1。由图1可见，4株乳酸菌的生长趋势较为一致，发酵0～10 h，处于对数生长期，均明显呈现出快速生长趋势；发酵10～20 h，进入生长稳定期；发酵20 h后，进入衰亡期。在发酵2～48 h，菌株ZZU 457和ZZU 466的生物量均明显高于菌株ZZU 456和ZZU 473。

2.3产酸特性筛选得到的4株高抗菌活性乳酸菌在液体MRS培养基中的产酸曲线见图2。由图2可见，与不接种的自然发酵相比，发酵0～48 h，接种乳酸菌的发酵液pH值均明显下降，且在0～12 h下降速度较快，其中接种菌株ZZU 457和ZZU 466的发酵液pH值均明显低于菌株ZZU 456和ZZU 473。

图1　筛选菌株的生长曲线

图2　筛选菌株的产酸曲线

2.4生理生化特征菌株ZZU 457和ZZU 466的生理生化特征见表2。由表2可见，两株菌均呈短杆状、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，且均为同型发酵类型，能够耐受3.5%～6.5%的盐浓度环境；在温度为5℃和50℃环境中，菌株ZZU 457仅能够微弱生长，而菌株ZZU 466均能够良好生长；菌株ZZU 457微弱耐受pH为3.0的环境，能够耐受pH为3.5的环境，菌株ZZU 466微弱耐受pH为3.0和3.5的环境，能够耐受pH为4.0的环境。

表2　乳酸菌的生理生化特征

2.5发酵苜蓿粉特性菌株ZZU 457和ZZU 466在苜蓿粉中的产酸曲线见图3。由图3可见，与自然发酵相比，接种乳酸菌的苜蓿粉pH值在0～54 h均明显降低，在0～12 h时下降速度均较快，在36 h时均达到最低。与接种菌株ZZU 457相比，接种ZZU 466的苜蓿粉pH值在2～54 h时较低，且在36 h时达到最低，为4.2。

图3　乳酸菌发酵苜蓿粉的pH值

2.6菌种鉴定优良乳酸菌ZZU 466在形态学上呈短杆状、乳白色，结合其在系统进化树上的位置，初步被鉴定为融合魏斯氏菌，图4为该菌株的系统进化树。

图4　优良菌株的16S rRNA基因序列系统进化树

3　讨论

本研究发现，与接种菌株ZZU 466相比，接种ZZU 457在MRS液体培养基中发酵8 h后的生物量较高，发酵液pH值较低，且能够耐受pH为3.5的酸性环境，然而在苜蓿粉中发酵8 h后发酵液的pH值却较高。说明在MRS培养基中生长较好且产酸较多的乳酸菌不一定在苜蓿粉发酵过程中产酸较多。Muck（1989）报道，并不是所有乳酸菌都能对苜蓿材料发挥较好的作用，可能是因为添加的菌株在目标作物上不易生长或不生长。为了保证添加剂的有效活力，避免菌种因为作物营养或与其他微生物之间的竞争等因素引起的对环境条件的不适应，应该有针对性地筛选适于苜蓿青贮的乳酸菌。本试验筛选的优良乳酸菌ZZU 466不仅具有较好的抗菌活性，而且在发酵苜蓿粉过程中产酸性能较好，将有望被开发为苜蓿青贮添加剂，用以调制优质动物苜蓿青贮饲料。

4　结论

4.1本试验从郑州地区9个苜蓿样品中分离到的19株乳酸菌中，筛选到4株对指示菌如大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌抗菌活性均较好的菌株。

4.2乳酸菌ZZU 457和ZZU 466在MRS培养基中生长较好且产酸较多，发酵苜蓿粉性能较好，其中菌株ZZU 466发酵苜蓿粉性能优于菌株ZZU 457。

4.3菌株ZZU 466能够耐受6.5%的盐浓度，耐受5～50℃温度环境及pH 4.0的酸度环境，被鉴定为融合魏斯氏菌。

［1］李改英，高腾云，傅彤，等.影响苜蓿青贮的因素及其青贮技术的研究进展［J］.动物营养与饲料科学，2010，37（12）：22～26.

［2］王永新，蒙淑芳，许庆方，等.淋雨和添加剂对苜蓿青贮品质的影响［J］.草地学报，2012，20（3）：565～570.

［3］许庆方.影响苜蓿青贮品质的主要因素及苜蓿青贮在奶牛日粮中应用效果的研究：［博士学位论文］［D］.北京：中国农业大学，2005.

［4］Muck R E．Effect of inoculation level on alfalfa silage quality［J］.Transactions of the ASABE，1989：32（4）：1153～1158.

［5］Ni K K，Wang Y P，Li D X.Characterization，identification and application of lactic acid bacteria isolated from forage paddy rice silage［J］.PloS ONE，2015，10（3）：1～14.

［6］Pang H L，Zhang M，Qin G Y.Identification of lactic acid bacteria isolated from corn stovers［J］，Animal Science Journal，2011，82（5）：642～653.

The purpose of this research was to screen high quality lactic acid bacterias for alfalfa silage.9 alfalfa samples of Zhengzhou area were selected by comparing of their antimicrobial activity or growth features and acid production features.Stains of the ideal samples were identified according to the sequence of 16S rDNA and the physiological and biochemical characteristics.The fermentation features of alfalfa meal for the excellent strains were also studied.We got 4 lactic acid bacterias that performed a higher activity to inhibit of indicator bacterias.Only ZZU 457 and ZZU 466 of 4 strains showed high rate of growth and acidification in MRS liquids.ZZU 457 could tolerant temperature of 10～4.5℃and low pH environment（pH 3.5）.Strain of ZZU 466 could survive in temperature of 5～50℃and low pH environment（pH 4.0）. Results of the alfalfa meal fermentation indicated that both two strains could produce acid quickly within 18 hours，especially for strains of ZZU 466.It could reduce the pH to the lowest value of 4.2 for the alfalfa meal fermentation liquids at 36 hours.According to the physiological and biochemical test，analysis of the 16S rRNA sequence identified that this strains was W.corfusa.The strain of ZZU 466 had potential value of application as an additive in alfalfa silage.

alfalfa；fermentation；lactic acid bacteria；screening；characteristics

S816.7

A

1004-3314（2016）12-0035-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161209

河南省重点科技攻关项目（152102110045、152102310064）；河南省基础与前沿技术研究项目（162300410131）；郑州大学研究生教学改革项目（YJSJY201407）