替硝唑有关物质检查方法改进

尼珍，边巴卓玛，阿萍

（西藏自治区食品药品检验所，西藏拉萨850000）

替硝唑有关物质检查方法改进

尼珍，边巴卓玛，阿萍

（西藏自治区食品药品检验所，西藏拉萨850000）

目的改进替硝唑有关物质的检查方法。方法使用Zorbax SB-C8柱（250 mm×3.0 mm，5 m），流动相为水-甲醇-乙腈（83∶7∶10），检测波长为320 nm，流速为0.5 mL/min，柱温为35℃，进样量为20 L。结果在此色谱条件下，替硝唑与有关物质均能完全分离；替硝唑有关物质A、甲硝唑及替硝唑有关物质B的质量浓度在1～100 g/mL（r=1.000 0）范围内与峰面积线性关系良好；替硝唑杂质A、甲硝唑及替硝唑杂质B的检测限分别为0.04，0.20，0.20 ng；杂质A的平均回收率为96.23%，RSD为1.52%（n=6）；甲硝唑的平均回收率为95.34%，RSD为1.64%（n=6）；杂质B的平均回收率为96.72%，RSD为1.33%（n=6）。结论该方法简便，准确，专属性强，可用于替硝唑有关物质检查。

高效液相色谱法；替硝唑；有关物质

替硝唑是一种抗厌氧菌及抗原虫感染的药物，是继甲硝唑后疗效更佳、疗程更短、耐受性更好、体内分布更广的硝咪唑类衍生物，于20世纪60年代后期由美国辉瑞公司研究开发，商品名为Fasigyn，1972年在瑞士和西德上市，1991年《日本药局方》12版改正版已收载（JP 557页）。1993年，湖北省医药工业研究所率先在国内独家研制成功，并取得了卫生部颁发的新药证书［93（卫药证字X-65）号］。同年，丽珠制药厂替硝唑片（丽珠快服净）获卫生部颁发的生产批准文号［93（卫药试字X-28-1）号］［1-3］。2010年版《中国药典》（ChP 2010）、《日本药局方》16版（JP 16）、《欧洲药典》7.0版（EP 7.0）、《英国药典》2013版（BP 2013）及《美国药典》35版（USP 35）均收载了替硝唑，但对有关物质的检查方法均不相同。ChP 2010、EP 7.0和BP 2013中均采用高效液相色谱（HPLC）法，USP 35和JP 16采用薄层色谱（TLC）法。本研究中借鉴EP 7.0中该品种的杂质控制相关信息，建立了系统适用性更强、分离度更好的替硝唑有关物质检查方法，为进一步完善和提高《中国药典》替硝唑有关物质检查方法提供参考。

1　仪器与试药

1.1仪器

E2695型液相色谱仪，2998紫外检测器，Empower色谱工作站（Waters公司）。

1.2试药

替硝唑杂质A对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100512-200802，含量为99.8%）；甲硝唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100191-200606，含量为99.9%）；替硝唑杂质B对照品（浙江苏泊尔制药有限公司，批号为B001-001，含量为99.7%）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水；14批替硝唑原料分别由浙江苏泊尔制药有限公司和印度Aarti Rrugs Limited公司提供。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C8柱（250 mm×3.0 mm，5 μm）；流动相：水-甲醇-乙腈（83∶7∶10）；检测波长：320nm；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：20 μL。

2.2溶液制备

供试品溶液：取样品（批号为001-130963）约10.0 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇2 mL溶解，加流动相至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液a：取供试品溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液b：称取替硝唑杂质A对照品、甲硝唑对照品和替硝唑杂质B对照品各约5.0 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇10 mL溶解，加流动相至刻度，摇匀，取此溶液2.0 mL置10 mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。本溶液作为系统适用性溶液［2］。

2.3方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2项下对照品溶液b、供试品溶液和空白对照溶液（流动相）各20 μL，按拟订色谱条件分别进样测定，结果供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处有相应色谱峰，而空白对照溶液则无此色谱峰，表明无干扰，见图1。

图1　高效液相色谱图

线性关系考察：精密称取替硝唑杂质A对照品、甲硝唑对照品和替硝唑杂质B对照品适量，用流动相配制系列质量浓度的混合对照品溶液1，5，10，20，40，80，100 μg/mL，按拟订色谱条件分别精密进样20 μL，记录色谱图。以各对照品溶液进样质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：替硝唑杂质A为Y=125 588 X+9 138.3，r= 1.000 0；甲硝唑为Y=99 542 X-865.2，r=1.000 0；替硝唑杂质B为Y=55 168 X-2 949.1，r=1.000 0。结果表明，各杂质质量浓度在1～100 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限测定：取“线性关系考察”项下质量浓度为10 μg/mL的对照品溶液，用稀释法测定检测限。按S/N=3计算，替硝唑杂质A、甲硝唑及替硝唑杂质B的检测限分别为0.04，0.20，0.20 ng。

精密度试验：精密吸取2.2项下对照品溶液b20 μL，连续进样6次。结果杂质A峰面积的RSD为0.14%（n=6），甲硝唑峰面积的RSD为0.16%（n=6），杂质B峰面积的RSD为0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取2.2项下供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，20，36，48 h进样20 μL，记录峰面积。结果杂质A峰面积的RSD为0.26%（n=8），甲硝唑峰面积的RSD为0.39%（n=8），杂质B峰面积的RSD为0.58%（n=8），表明供试品溶液在48 h内较稳定。

耐用性试验：精密吸取2.2项下供试品溶液，用2个不同品牌的色谱柱，即资生堂UG120 C8柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）和安捷伦Zorbax SB-C8柱（250 mm× 3.0 mm，5 μm），按拟订色谱条件分别精密进样20 μL。结果杂质A峰面积的RSD为1.46%，甲硝唑峰面积的RSD为1.47%，杂质B峰面积的RSD为0.97%，表明该方法系统耐用性较好。

加样回收试验：精密称取已知含量杂质A、甲硝唑及杂质B的样品（批号为001-130963，杂质A、甲硝唑及杂质B的含量分别为0.02%，0.01%，0.09%）约5.0 mg，共6份，分别精密加入含杂质A、甲硝唑及杂质B的混合对照品溶液（质量浓度杂质A为1.02 μg/mL，甲硝唑为0.51 μg/mL，杂质B为4.48 μg/mL）1.0 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别精密进样20 μL，计算回收率，结果见表1。

2.4有关物质含量测定

按2.2项下方法制备各供试品溶液，按拟订色谱条件分别精密进样20 μL，按外标法（用于杂质A、甲硝唑及杂质B）和自身对照法（用于其他杂质）计算有关物质含量。结果见表2。

3　讨论

3.12种有关物质检查方法的比较

ChP 2010和EP 7.0均采用高效液相色谱法。ChP 2010中只检查非特定杂质，EP 7.0中检查特定杂质A、杂质B及其他非特定杂质。使用EP 7.0方法测定的供试品溶液色谱图中杂质峰的数量较多且分离度较好。另外，ChP 2010中供试品溶液和对照品溶液制备使用流动相溶解，而流动相含80%水系，替硝唑本身几乎不溶于水，造成溶解困难；EP 7.0中供试品溶液和对照品溶液制备使用甲醇溶解，替硝唑略溶于甲醇，故由溶解不完全造成的误差较小。ChP 2010中流动相使用0.05%磷酸二氢钾溶液-甲醇（80∶20），EP 7.0中使用乙腈-甲醇-水（10∶20∶70），此流动相对色谱柱损伤相对较小，能延长其使用寿命。

表1　加样回收试验结果（n=6）

表2　有关物质含量测定结果（%）

3.2供试品溶液质量浓度确定

EP 7.0中替硝唑供试品溶液的质量浓度为0.1 mg/mL，此质量浓度太低造成杂质峰面积积分不准确，故本研究中供试品溶液的质量浓度定为1.0 mg/mL。3.3系统适用性溶液制备

目前，大都采用2种基本原料合成替硝唑，即以2-甲基-5-硝咪唑或甲硝唑为原料合成替硝唑［4-6］。替硝唑杂质A和杂质B来源明确，分别为起始物料2-甲基-5-硝咪唑和反应副产物1-［2-（乙基磺酰基）乙基］-2-甲基-4-硝基-1H-咪唑。EP 7.0中以杂质A和杂质B的混合对照溶液作为系统适用性溶液，但未考虑甲硝唑，而在样品中除检出杂质A和杂质B外，也检出甲硝唑，我们认为可将甲硝唑列入替硝唑的特定杂质检查中。故制备了2.2项下含杂质A、甲硝唑和杂质B的混合对照溶液，并作为系统适用性溶液。

3.4流动相选择

当使用EP 7.0中流动相比例水-甲醇-乙腈（70∶20∶10）时，2.2项下的系统适用性溶液只检出2个峰，表明该流动相的分离度不好。调节流动相比例至水-甲醇-乙腈（80∶10∶10）后，各组分得以分离，但甲硝唑与杂质B分离度为1.8，不太理想。调节流动相比例至水-甲醇-乙腈（83∶7∶10）后，甲硝唑与杂质B分离度达到2.7，能够接受。

综上所述，改进后的方法能很好地用于替硝唑有关物质的检查，且方法中规定的各特定有关物质与替硝唑合成工艺相关，能较好地反映工艺过程及工艺稳定性。

［1］胡葆诚，曹筱秀.国内上市的5-硝基咪唑药物评价［J］.医药导报，1995，14（2）：75-76.

［2］杨阳.替硝唑［J］.中国药理学通报，1994，10（5）：386.

［3］杜达耿.替硝唑简介［J］.中国医院药学杂志，1994，14（5）：232.

［4］张珩，陈中，杨艺虹，等.替硝唑合成工艺的改进［J］.精细化工，2002，19（6）：332-333.

［5］郭春.替硝唑合成路线图解［J］.中国医药工业杂志，1996，27（7）：336.

［6］杨艺虹，杨建设，张珩，等.替硝唑合成路线评述［J］.武汉化工学院学报，2001，23（1）：31-33.

Improvement Method for Tinidazole Related Substances

Nizhen，Bianbazhuoma，Aping
（Tibet Institute for Food and Drug Control，Lhasa，Tibet，China850000）

ObjectiveTo improve the method for Tinidazole related substances.MethodsZorbax SB-C8（250 mm×3.0 mm，5 μm）column was used with a mobile phase of water-methanol-acetonitrile（83∶7∶10）.The flow rat was 0.5 mL/min with column temperature at 35℃，the wavelength of detect was set at 320 nm.ResultsUnder the established chromatographic conditions，tinidazole and the related substances were separated completely.The standard curves obtained from impurity A，metronidazole and impurity B were linear within the range of 1-100 μg/mL with the correlation coefficient of r=1.000 0，the limits of detection were 0.04，0.20，0.20 ng，the average recovery rate of impurity A was 96.23%，RSD=1.52%（n=6），the average recovery rate of metronidazole was 95.34%，RSD=1.64%（n=6），and the average recovery rate of impurity B was 96.72%，RSD=1.33%（n=6）.ConclusionThe established method is simple，accurate，specific and can be used for determination related substances of tinidazole.

HPLC；tinidazole；related substances

R927.11；R978.61

A

1006-4931（2016）18-0070-04

尼珍（1975-），女，副主任药师，主要从事食品药品检验工作，（电话）0891-6813172（电子信箱）nizhen1221@163.com。

（2016-03-18；

2016-05-26）