贯叶金丝桃有效成分提取工艺研究

罗旭，唐小龙，杨宋琪，陈海燕，柯潇

（四川济生堂药业有限公司，四川成都611930）

贯叶金丝桃有效成分提取工艺研究

罗旭，唐小龙，杨宋琪，陈海燕，柯潇

（四川济生堂药业有限公司，四川成都611930）

目的优化贯叶金丝桃中有效成分的提取工艺。方法采用正交试验法，以金丝桃苷、黄酮总量（芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素）、干浸膏收率为考察指标，考察加乙醇量、乙醇体积分数、提取时间、提取次数4个因素，优选贯叶金丝桃的最佳提取工艺。结果贯叶金丝桃最佳提取工艺为提取2次，一煎加10倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，二煎加8倍量70%乙醇，每次煎煮1 h。结论该提取工艺对金丝桃苷及总黄酮有效成分的提取率高，重复性好，稳定可行。

舒肝解郁胶囊；贯叶金丝桃；正交试验；金丝桃苷；高效液相色谱法

舒肝解郁胶囊为我国首个治疗轻、中度抑郁症的中成药，主要功能为疏肝解郁、健脾安神，贯叶金丝桃为其主要成分之一。2015年版《中国药典（一部）》贯叶金丝桃质量控制指标为金丝桃苷。现代文献报道，贯叶金丝桃主要含黄酮类、苯骈二蒽酮类、间苯三酚类、挥发油类、香豆素等多种化学成分，其中黄酮类以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等为主要存在形式，也是主要的黄酮类化学成分［1-2］。现代药理研究证明，贯叶金丝桃黄酮类化学成分是舒肝解郁胶囊抗抑郁的主要活性成分之一［3-4］。本研究中利用正交试验法，采用高效液相色谱（HPLC）法，在同一色谱条件下测定金丝桃苷、黄酮总量（金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮素），并结合干浸膏得率作为主要考察指标，对贯叶金丝桃的提取工艺进行研究，现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent Chemstation化学工作站（美国安捷伦公司）；BP-211D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ250DE型超声波清洗器（昆山市仪器有限公司）。

1.2试药

芦丁对照品（批号为100080-201409，供含量测定用，纯度为91.9%），金丝桃苷对照品（批号为111521-201406，供含量测定用，纯度为92.5%），异槲皮苷对照品（批号为111809-201403，供含量测定用，纯度为92.9%），槲皮素对照品（批号为100081-201408，供含量测定用，纯度为99.1%），以上对照品均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈（美国Fisher公司）为色谱纯；水为超纯水；甲醇、乙醇、磷酸等为分析纯；贯叶金丝桃药材采于甘肃礼县，由成都康弘药业集团国家企业技术中心叶亮教授鉴定为藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分（批号分别为151101，151102，151103，151104）。

2　方法与结果

2.1含量测定［5-6］

2.1.1色谱条件及系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，0～26 min时A 16%，B 84%；26～40 min时A 16%→65%，B 84%→35%；检测波长为360 nm。理论板数（N）按金丝桃苷峰计算应不低于3 000。在此色谱条件下的色谱图见图1。

2.1.2溶液制备

对照品溶液：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素各30 μg的混合溶液，即得。

供试品溶液：取本品工艺下浸膏约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用80%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3方法学考察

线性关系考察：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素混合对照品溶液（质量浓度依次为0.324，0.232， 0.321，0.344 mg/mL），用移液管精密量取0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取5 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素标准曲线方程分别为Y=1 623.3 X+1.691 2，r=0.999 9；Y=2 174.4 X-1.766 7，r=0.999 9；Y=2 188.6 X+ 1.865 0，r=0.999 9；Y=3 845.3X+31.650，r=0.999 9。结果表明，进样量芦丁在0.081～1.62 μg范围内，金丝桃苷在0.058～1.16 μg范围内，异槲皮苷在0.081～1.62 μg范围内，槲皮素在0.086～1.72 μg范围内，与峰面积线性关系良好。

图1　高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取上述混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，分别测定峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.10%，0.15%，0.14%，0.22%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：称取贯叶金丝桃浸膏粉样品，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，共6份，测定峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.41%，1.32%，1.36%，1.45%（n=6），表明该方法重复性良好。

稳定性试验：取供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时，测定峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.21%，0.18%，0.24%，0.19%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取本品已知含量的浸膏粉样品，研细，取约0.1 g，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入相应的对照品适量，制备供试品溶液，进样测定含量，计算回收率，结果见表1。

表1　加样回收试验结果（n=6）

2.1.4样品含量测定

按供试品溶液制备方法制备样品溶液，精密吸取5 μL，注入高效液相色谱仪，测定芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的百分含量，并计算黄酮总量。结果见表2。

表2　含量测定结果（%）

2.2提取工艺正交试验［7-9］

取同一批贯叶金丝桃药材（批号为151101）4.5 kg，分成9批，每批0.5 kg，粉碎成粗粉，用不同体积分数乙醇加热回流提取，过滤，减压浓缩，回收乙醇，干燥，得贯叶金丝桃提取物，称定质量，计算出膏率，同时进行含量测定。以金丝桃苷含量、黄酮总量及出膏率为指标，采用正交试验对提取工艺进行优选。根据文献和预试验结果，提取前应先浸泡0.5 h，再选择乙醇量（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）、提取次数（D）4个试验因素，每个因素3个水平，按L9（34）正交表进行试验。因素水平、正交试验结果、方差分析分别见表3、表4、表5。

表3　正交试验因素水平表

2.3数据分析

试验指标为金丝桃苷和总黄酮，并兼顾出膏率，故分别对金丝桃苷含量、黄酮总含量、出膏率进行方差分析，并用综合评分法进行分析和比较。综合评分计算方法：以得率最大者为100%，将其他组别结果换算为最高值的百分比，以出膏率、金丝桃苷含量和黄酮总量权重分别占30%，35%，35%的比例进行相加后所得的值。

由表4可见，各影响效果依次为D＞B＞A＞C。由表5可见，因素D提取次数有显著性差异（P＜0.05），其他因素无显著性差异。综合分析得最佳工艺为A2B2C3D2，即每次加10倍量70%乙醇，煎煮1.5 h，提取2次。由于乙醇量和提取时间不是显著性因素，根据生产实际情况，最终确定贯叶金丝桃提取2次，一煎加10倍量70%乙醇，二煎加8倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，每次煎煮1 h。

表4　L9（34）正交试验结果

表5　方差分析结果

2.4验证试验

为确定工艺的优劣和稳定性，取3批贯叶金丝桃药材（批号分别为151102，151103，151104），对以上工艺进行验证试验，结果见表6。可见，此工艺稳定可靠，合理可行。

表6　验证试验结果

3　讨论

本试验中采用正交优化试验法，以金丝桃苷含量、黄酮总量和出膏率的加权平均进行综合评分，以加醇量、乙醇浓度、提取次数和提取时间为因素优选贯叶金丝桃的提取工艺。对正交试验结果的方差分析表明，提取次数对各项指标综合评分有显著性影响（P＜0.05），而乙醇量、乙醇浓度、提取时间对各项指标综合评分无显著性影响。因此，最终优选工艺为提取2次，一煎加10倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，二煎加8倍量70%乙醇，每次煎煮1 h。验证结果表明，该工艺合理、稳定、可靠。

采用乙腈-磷酸系统，在同一色谱条件下梯度洗脱，对贯叶金丝桃中的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素进行测定。试验结果证明，该4个黄酮类成分分离度好，峰形尖锐，对称性好，理论板数高。同时证明该含量测定方法也适用于舒肝解郁胶囊成品中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量测定。

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Process of Extracting Effective Ingredients of Hypericum Perforatum

Luo Xu，Tang Xiaolong，Yang Songqi，Chen Haiyan，Ke Xiao
（Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan，China611930）

ObjectiveTo optimize the extraction technology of active ingredients inHypericum perforatum.MethodsOrthogonal test method was used.Hyperin，total flavonoids（rutin，hyperoside，isoquercitrin，quercetin），dry extract yield were the indexes，and the amount of ethanol，ethanol concentration，extraction time，extraction times were observed for the optimized extraction technology of Hypericum perforatum.ResultsThe optimum extraction was extracted twice，added 10 times the amount of 70%ethanol in the first decocting，soaked for 0.5 h，added 8 times the amount of 70%ethanol in the second decocting，each time decocting 1 h.ConclusionThe extraction rate of total flavonoids and hyperoside in this extraction technology is high，and the method is reproducible，stable and feasible.

Shugan Jieyu Capsules；hypericum perforatum；orthogonal test；hyperin；HPLC

TQ461；R284．2；R282．71

A

1006－4931（2016）16－0030－05

四川省重大产业技术创新专项，项目编号：2012CD00082；四川科技成果转化项目，项目编号：2012SC0029。

罗旭（1980-），男，大学本科，高级工程师，研究方向为中药质量标准，（电话）028-64287669（电子信箱）lx99346@163.com；柯潇（1983-），男，硕士研究生，高级工程师，研究方向为中药新药，本文通讯作者，（电子信箱）Txzz@cnkh.com。

（2016－05－18）