广西性病门诊患者泌尿生殖道沙眼衣原体株高分辨多位点测序分型研究

韩燕 尹跃平 朱邦勇 刘宏业 钟铭英

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所性病参比实验室 中国疾病预防控制中心性病控制中心（韩燕、尹跃平、刘宏业、钟铭英）；广西壮族自治区皮肤病防治研究所中心实验室（朱邦勇）

广西性病门诊患者泌尿生殖道沙眼衣原体株高分辨多位点测序分型研究

韩燕 尹跃平 朱邦勇 刘宏业 钟铭英

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所性病参比实验室 中国疾病预防控制中心性病控制中心（韩燕、尹跃平、刘宏业、钟铭英）；广西壮族自治区皮肤病防治研究所中心实验室（朱邦勇）

目的了解广西性病门诊患者中泌尿生殖道沙眼衣原体型别分布，同时对随访患者沙眼衣原体的感染情况进行分析。方法在广西壮族自治区皮肤病防治所收集泌尿生殖道沙眼衣原体感染患者，采集男性尿道和女性宫颈拭子标本，并对初筛阳性患者在治疗完成后进行随访和标本采集，同时采集患者基本信息和临床信息。应用QIAxtractor全自动核酸纯化仪提取DNA，巢式PCR扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白基因（ompA）和MLST（高分辨多位点测序分型）所需的CT046（hctB）、CT058、CT144、CT172和 CT682（pbpB）5个基因。对PCR产物进行序列测定，经序列比对和MLST型别分析获得菌株的ompA基因分型和型别，并用BioNumerics7软件对广西和意大利沙眼衣原体株绘制最小生成树。结果在44份来自初诊患者和6份来自随访患者的沙眼衣原体阳性样本中，42份成功进行沙眼衣原体ompA和MLST分型。共发现7种ompA基因型和15种hr⁃MLST分型的ST型别，其中有3种ST型别为首次报道。广西地区沙眼衣原体基因型别较意大利地区具有特征性。6例随访患者经分型方法鉴定3例为再次的新发感染，3例因未能成功进行基因分型而未能确诊。结论广西性病门诊患者感染的沙眼衣原体具有独特的型别，在随访中出现泌尿生殖道沙眼衣原体再感染病例。

沙眼衣原体；多位点测序分型；随访研究；聚类分析

沙眼衣原体感染是性传播疾病之一，2008年世界卫生组织（WHO）估计成人新发感染生殖道沙眼衣原体的人数达1亿［1］。近70%的女性和50%的男性感染沙眼衣原体后临床症状隐匿，这除了增加了沙眼衣原体的在性活跃的人群中传播的风险外，还可以导致沙眼衣原体上行感染，从而引发更为严重的后遗症［2⁃3］。治疗后沙眼衣原体阳性，在性活跃的人群中是一个很常见的现象，可能原因有再感染或治疗失败。基因分型是区分再感染和感染治疗失败的一种常用方法。沙眼衣原体传统的ompA基因分型的型别有限，在特定人群中型别的分布比较集中［4⁃6］。沙眼衣原体多位点序列分型（MLST）由Markus等首次研发并应用，比以ompA为基础的分型技术具有更高的分辨力［7］。该方法选用沙眼衣原体的5个基因即CT046（hctB）、CT058、CT144、CT172和CT682（pbpB），目前已成功对来自16个国家不同人群的2 089例沙眼衣原体感染者的标本进行分型［8］。我们对广西泌尿生殖道沙眼衣原体临床株进行ompA分型和hr⁃MLST分型，了解沙眼衣原体的型别分布以及随访患者的沙眼衣原体感染情况。

资料和方法

一、标本收集

2014年5月至2015年9月在广西壮族自治区皮肤病防治所收集病例。经过沙眼衣原体抗原检测试剂盒（乳胶法）［艾博生物技术（杭州）有限公司］初筛，共收集44例实验室确诊的沙眼衣原体感染患者标本。其中男性尿道拭子标本32份，女性宫颈拭子标本12份，均于-70℃保存，冷链运送至性病中心参比实验室。本研究通过中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准。所有初筛阳性的患者在获取检查报告时，填写知情同意书后，由实验室工作人员采用统一的调查表对其进行基本信息、疾病相关信息、治疗相关信息的采集，并告知患者在治疗完成后3～5周进行复诊。有16例患者遵医嘱用药并在规定的时间内进行复诊，对这些患者在治疗期间是否采取了保护性措施进行调查并征得其同意后，继续留取标本。标本处理同初筛标本的采集和处理。

二、DNA提取和核酸检测

使用德国Qiagen公司生产的QIAxtractor全自动核酸纯化仪提取DNA，实验操作按照说明书及提取液样本的试验方案进行。参照沙眼衣原体核酸检测试剂盒说明书（广州中山大学达安基因股份有限公司）进行沙眼衣原体核酸检测。

三、ompA和hr⁃MLST基因分型

参照乌拉普斯大学沙眼衣原体MLST数据库网站（http：//mlstdb.bmc.uu.se）提供的引物序列、PCR反应体系和扩增程序进行。各分型基因的引物见表1。所有的引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成，PCR总反应体系为25 μl，包括5 μl DNA标本，2×Premix Taq（反应预混液），上下游引物（最终浓度为0.4 μmol/L），扩增程序如下：95 ℃变性15 min，扩增40个循环（94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃90 s），72℃延伸10 min，4℃保温。PCR产物送至上海顶卓生物科技有限公司进行纯化，对目的基因扩增产物进行双向测序。测序完成后，进入网站http：//mlstdb.bmc.uu.se/查询，获取每个标本每个基因等位基因的型别，最后综合5个基因的等位基因型别查询获得该菌株的基因型别。利用Pubmed网站的BLAST数据库进行序列比对获得该菌株的ompA基因型别。每个标本的6个基因位点均能成功扩增并测序方可进行后续分析。ompA和MLST分型实验均使用由E⁃bour（VR⁃348B）株（美国ATCC公司）提取DNA进行质控。

表1 沙眼衣原体巢式PCR的引物序列

四、数据分析

在 PubMed网站选用关键词“MLST”和“Chlamydia trachomatis”进行文献搜索，共检出26篇文献，全文下载阅读后仅有1篇文献公布了每例患者的MLST型别［9］。利用BioNumerics 7（比利时Applied Maths公司）软件进行聚类分析。

结 果

一、临床资料

共收集感染者标本44份，随访标本16份。所有感染者标本核酸检测均为阳性，随访者标本中有6份核酸检测为阳性。所有核酸检测阳性的标本（50份）均进行ompA和hr⁃MLST基因分型，其中42份标本所有的基因均得到有效扩增，可以进行后续测序分析，有效分型率84.0%（42/50）。ompA成功分型43份，MLST中CT058基因的分型成功份数最少，为42份；多重感染在本研究中未发现。

44例感染者中男32例（72.7%），女12例（17.3%），年龄（35.75±11.24）岁；汉族38例（86.4%），壮族6例（13.6%）；11例患者未婚，占25.0%；来自南宁市20例，来自广西其他城市21例，来自福建和广东3例。25例患者因尿道不适症状就诊，14例因泌尿生殖道出现异常分泌物就诊，4例因性伴感染自行体检就诊，1例未回答。病程（15.3±9.7）d，最短5 d，最长45 d。29例（65.9%）患者就诊前3个月内与临时性伴发生性关系，其中22例（75.9%）为商业性行为。

44例感染者经过治疗后共有16例（36.4%）患者在治疗4周后进行了随访。随访中男12例，女4例，4例未婚，12例已婚。来自南宁8例，来自其他城市8例。11例（68.8%）在就诊前3个月与临时性伴发生性关系，其中9例（81.8%）为商业性行为。该16例患者均遵医嘱服药。16例中有6例（37.5%）经核酸检测仍为阳性。

二、沙眼衣原体ompA基因型别及MLST型别分布

在成功扩增的42例沙眼衣原体菌株中，发现ompA基因型7种，hr⁃MLST分型的ST型别15种，其中有3种为新发现的MLST型别，占7.1%（3/42）。E型（28.6%）、F型（26.2%）和D型（19.1%）为主要流行ompA基因型别，E⁃3（26.2%）、F⁃110（21.4%）和J⁃264（16.7%）为主要流行的ompA⁃hrMLST型别。见表2。

对来自广西性病门诊患者的42株与来自意大利在校学生的40株沙眼衣原体菌株的ST型别进行最小生成树分析，结果显示这些菌株可以分成6个簇，其中簇Ⅰ和簇Ⅳ来自意大利，簇Ⅲ（n=10）来自广西；簇Ⅱ、簇Ⅴ和簇Ⅵ均为混合簇，簇Ⅵ来自广西7例和意大利4例，簇Ⅴ中仅有1株来自广西，其余6株均来自意大利，簇Ⅱ中仅有3株来自意大利，其余12株均来自广西。广西地区的菌株基本与意大利的菌株独自形成簇。见图1。

随访16例患者均遵医嘱服药，有5例患者在治疗期间进行了保护性性生活。随访标本经核酸检测后有6例阳性，6例患者均在治疗期间未进行性生活，3例成功进行基因分型，其中2例ompA基因型别不一致，3例MLST型别均不一致，可判断为再感染，其余3例因型别未鉴定无法判别。

讨 论

MLST是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过分析多个管家基因450 bp左右的核心片段的核酸序列对菌株的等位基因进行多样性比较。沙眼衣原体MLST官方网站上选用7个看家基因（enoA、fumC、gatA、gidA、hemN、flX、oppA）［10］，至今共得到44种基因型别；Uppsala大学选用5个基因［CT046（hctB），CT058，CT144，CT172，CT682（pbpB）］［7］，目前收录型别415个，是目前应用广泛的沙眼衣原体MLST分型方案，已经被MLST网站收录。

表2 广西性病门诊患者沙眼衣原体hr⁃MLST和ompA型别分布

图1 广西性病门诊患者与意大利在校学生沙眼衣原体MLST分型的最小生成树 每个圆圈代表1个ST型别，圆圈的大小代表相同ST型别菌株的多少；绿色圆圈表示广西菌株，红色圆圈表示意大利菌株。阴影代表集群

我们首次报道广西沙眼衣原体的MLST型别分布，发现沙眼衣原体MLST型别分布，与意大利报道的年轻大学生有较为明显的差异［9］，同时还发现3种新MLST型别。Versteeg等［11］对我国南京地区性病门诊患者感染的沙眼衣原体进行MLST分析，在成功分型的91例标本中分出34种型别，其中24种为当时数据库未收录的型别，聚类分析发现南京菌株较荷兰阿姆斯特丹菌株有着独特的菌株，同时有部分重叠，这些地理距离较远的国家具有相似ompA⁃MLST型别沙眼衣原体菌株的主要原因可能是这些菌株的基因组比较稳定，存在于这些国家很长一段时间，这些ST型别可能即为所谓的起源菌株。此外也有可能是这些菌株内在的毒力较强可以感染分布在世界各人群［12］。但我们的研究只局限于广西的一个性病门诊，收集菌株的代表性不够。8例患者标本ompA⁃MLST分型没有成功，其DNA含量均为1×103拷贝/ml左右，没有能够成功分型可能与标本的DNA含量较低有关，但标本中沙眼衣原体DNA含量的差异与基因型别之间无相关性［13⁃14］，这些没有被成功分型的菌株是否会影响菌株型别的分布以及是否存在新的基因型别菌株尚不知。

如何在随访的患者中区分沙眼衣原体的再感染和原感染治疗失败对于沙眼衣原体感染的预防控制有着重要的意义：对于再感染，应对方案是加快性伴的治疗、提倡安全的性行为；对于感染治疗失败，应对现有治疗方案调整［14］。本研究44例患者中仅有16例患者进行了随访，随访率较低。6例患者在随访中检测为阳性，3例随访的标本基因型别与初诊时的标本不一致，因此均为再次新发感染。Götz等［15］对27例随访且再检测阳性患者的初诊和随访标本进行MLST分型，发现63%患者初诊和随访时感染的沙眼衣原体型别不一致。对于治疗失败的病例一般需要更换治疗方案，但确诊为再感染则只需沿用原治疗方案继续治疗。在临床上，应该加强患者的随访意识，并通过有效的基因分型手段辅助鉴定随访中沙眼衣原体阳性患者感染的类型，从而更好地指导临床。

［1］World Health Organization.Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections⁃2008.2012［R/OL］.Geneva：WHO press,2012［2016⁃01⁃15］.http://www.who.int/reproductivehealth/publications/rtis/stisestimates/en/index.html.

［2］Cicinelli E,Matteo M,Tinelli R,et al.Chronic endometritis due to common bacteria is prevalentin women with recurrent miscarriage as confirmed by improved pregnancy outcome after antibiotic treatment［J］.Reprod Sci,2014,21（5）:640⁃647.DOI:10.1177/1933719113508817.

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［15］Götz HM,Bom RJ,Wolfers ME,et al.Use ofChlamydia trachomatishigh⁃resolution typing:an extended case study to distinguish recurrent or persistent infection from new infection［J］.Sex Transm Infect,2014,90（2）:155⁃160.DOI:10.1136/sextrans⁃2013⁃051218.

（本文编辑：尚淑贤）

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香港澳美制药厂有限公司有权使用应征文章，并对本次活动拥有最终解释权。咨询电话：021-63200090产品部。

阿维A（方希）治疗特殊皮肤病病例有奖征集通知

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稿件要求：①参赛病例均未在国内外医学期刊上发表；②病例资料完整，包括疾病描述、体检、皮肤科检查、临床图片、病理图片（必要时提供）、诊断、治疗、讨论；③完整病例稿件包括word文档和PPT文档各1份。

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3.征稿时间：2016年2月1日至10月31日。

4.投稿途径：将病例邮件发至fangxihuabang@126.com并写清联系人、单位和联系方式，邮件主题名：阿维A治疗特殊皮肤病病例有奖征集。对符合《中华皮肤科杂志》或《中国皮肤性病学杂志》要求的病例，推荐发表。

详情致电市场部023⁃67886926，或向当地本公司医学支持人员咨询。重庆华邦制药有限公司保留对本次活动的解释权。

High⁃resolution multilocus sequence typing of urogenital Chlamydia trachomatis among STD clinic outpatients in Guangxi Zhuang Autonomous Region

Han Yan,Yin Yueping,Zhu Bangyong,Liu Hongye,Zhong Mingying
Reference Laboratory of STD,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control,China Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210042,China（Han Y,Yin YP,Liu HY,Zhong MY）;Central Laboratory,Institute of Dermatology of Guangxi Zhuang Autonomous Region（Zhu BY）

ObjectiveTo investigate the type distribution of urogenitalChlamydia trachomatis（Ct）among STD clinic outpatients in Guangxi Zhuang Autonomous Region,and to estimate the prevalence of Ct infection among the patients during posttreatment follow⁃up.MethodsUrethral and cervical swabs were collected from male and female outpatients with confirmed urogenital Ct infection,respectively,in Institute of Dermatology of Guangxi Zhuang Autonomous Region.The patients with positive results in preliminary screening tests were followed up after treatment,and specimens were collected at follow⁃up visits.General and clinical information was also obtained from these patients.DNA was extracted from these samples by using the QIAxtractor instrument.Nested PCR was performed to amplify the major outer membrane protein A（ompA）gene for ompA typing,and to amplify CT046（hctB）,CT058,CT144,CT172 and CT682（pbpB）genes for high⁃resolution multilocus sequence typing（hr⁃MLST）.Then,PCR products were sequenced,and ompA and MLST types of Ct were determined by sequence alignment and MLST analysis,respectively.The obtained MLST sequence types（STs） were compared with those from an Italian population by using the BioNumerics7 software,and a minimum spanning tree（MST）was generated.ResultsTotally,44 and 6 Ct⁃positive specimens were collected at first visits and follow⁃up visits respectively.Among the 50 specimens,42 underwent successful ompA typing and hr⁃MLST,and 7 ompA genotypes and 15 hr⁃MLST STs were identified,including 3 first reported STs.The distribution of STs of Ct isolates from Guangxi Zhuang Autonomous Region was significantly different from that from the Italian population.Among the 6 followed patients with posttreatment Ct infection,3 were confirmed to be reinfected with Ct,and the other 3 failed to be diagnosed because of unsuccessful genotyping.ConclusionThe genotypes of Ct strains isolated from STD clinic outpatients in Guangxi Autonomous Region were characteristic,and Ct reinfection occurred in some patients during follow⁃up.

Chlamydia trachomatis;Multilocus sequence typing;Follow⁃up studies;Cluster analysis

Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

2016⁃01⁃26）

尹跃平，Email：yinyp@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.10.003

北京协和医学院协和青年基金（33320140135）

Fund program:PUMC Youth Fund（33320140135）