棘阿米巴副衣原体病原学研究进展

刘 彦，吴移谋

副衣原体科（Parachlamydiaceae）是1997年首次从2例女性阿米巴感染者鼻黏膜中分离出来的细胞内共生体，可观察到原体、网状体及新月体3种不同的发育期，大量证据表明它与人类呼吸道感染密切相关，还可能与动物的泌尿生殖道、眼部感染及全身性疾病有关，1999年被正式命名。副衣原体科主要包括棘阿米巴副衣原体（Parachlamydiaacanthamoeba，Pa）和哈氏变形虫新衣原体（Neochlamydiaartmanellae，Nh）两个属。副衣原体属目前仅有棘阿米巴副衣原体（P．acanthamoebae，Pa）一个单独的种类，本文就棘阿米巴副衣原体分类、病原学特征及分离培养方法研究进展作一综述。

1 棘阿米巴副衣原体分类

一个新的物种的鉴定，一般应该分析5种不同的种系进化。由于棘阿米巴副衣原体的基因序列尚未完全明确，目前主要是根据16SrRNA基因、23S rRNA基因、RNase P RNA基因及全基因的种系进化进行分类。Everett等通过对肺炎嗜衣原体（Chlamydophilapneumoniae）16SrRNA 基 因（GenBank登录号为U68426）和／或23SrRNA基因（GenBank登录号为U73784）的种系进化分析认为，与16SrRNA或23SrRNA基因同源性大于95% 的属于衣原体科，反之则属于副衣原体科。副衣原体科分为两个属，其典型菌株分别是棘阿米巴副衣原体和哈氏变形虫新衣原体，目前已发现8个种的棘阿米巴副衣原体，分别为BN9、Bergl7、Hall’s球菌、UWE1、UWE25、UWC22、TUME1和 CorvenA4株。理论上认为，16SrRNA基因序列在同一属的细菌中差别很小，同源性至少应该在97%以上；但经过比较，发现 UWE1、UWE25、UWC22、TUME1及CorvenA4等5株棘阿米巴副衣原体的16SrRNA基因与BN9株的同源性介于91% ～93%之间，说明棘阿米巴副衣原体在种系进化中具有呈多样性。

2 棘阿米巴副衣原体病原学特征

2．1 形态与结构 棘阿米巴副衣原体可自然感染棘阿米巴的滋养体阶段，是其细胞内共生体，复制周期与衣原体相似。电镜下可观察到原体（elementary body，EB）和网状体（reticulate body，RB）两种基本结构，有时可见新月体（crescent body，CB）（图1）。原体和网状体均可存在于棘阿米巴滋养体的空泡内，但革兰染色结果不一致。

原体呈球形或椭球形，直径为0．3～0．5μm，主要定位于棘阿米巴滋养体的空泡内，随着培养时间的增加而增多，是副衣原体成熟阶段，革兰氏染色呈阳性。电镜下可见原体细胞壁厚，有致密的类核结构和少量的核糖体（图1A）。原体EB在外界环境较稳定，无繁殖能力，但具有高度的感染性；当进入棘阿米巴滋养体后，在其棘伪足包绕形成的空泡即吞噬空泡中逐渐发育，体积增大进入增殖状态，形成始体。

网状体呈球形，直径稍大于原体，约为0．5～0．7μm，不同的菌株原体和始体直径相差比较大，Hall’s coccus株始体直径约0．6μm，BN9株直径可达到1．0μm，CorvenA4株直径为0．9μm。始体是副衣原体在棘阿米巴细胞质内的一个主要阶段，但是在棘阿米巴的吞噬空泡中也数量众多。始体呈二分裂相增殖，细胞壁薄，革兰染色呈阴性。电镜下可见始体电子密度低，无致密核质，内有纤细的网状结构，又叫始体（initial body，IB）（图1B）。

新月体与原体和网状体共存，是原体和网状体发育的中间阶段，具有感染性，大量存在于外界环境中，还可寄生于棘阿米巴的吞噬空泡中，但在棘阿米巴胞浆内没有发现；其主要功能可能是延长潜伏期。电镜下可见新月体呈新月状，大小约为0．3×0．6μm，细胞壁厚（图1C），革兰氏染色呈阳性。新月体发生机制尚不清楚，与共培养时间有关，随着培养时间的延长，新月体出现频率增加。新月体已见于副衣原体Berg17株、BN9和Hall’s coccus株，而衣原体均未见报道，因此新月体有可能用来作为区别衣原体分类的一个形态学特征。

图1 棘阿米巴副衣原体（Hall’s coccus株）3个不同阶段的形态结构（电镜，×45 600）A：原体；B：网状体；C：新月体（Gilbert Greub and Didier Raoult，2002）Fig．1 Morphology of the three different stages of Parachlamydia acanthamoeba （Hall＇s coccus strain）（Electron microscopy，×45 600）（Greub G and Raoult D，2002）A：Elementary body；B：Reticulate body；C：Crescent body

2．2 发育周期 原体和新月体在外界环境性质均较稳定，富有感染性，可通过表面受体吸附于棘阿米巴滋养体，棘阿米巴伸出棘状伪足将其吞入，并由自身胞膜包绕原体和新月体形成吞噬空泡（图2）；原体和新月体在吞噬空泡中逐渐发育、增大成为网状体。有时可见散在的原体游离分布棘阿米巴胞浆中，而未见吞噬空泡，其形成来源可能为：①由体外经滋养体的胞吞作用进人胞浆中的原体，尚未开始形成吞噬空泡；②在成熟吞噬空泡中，发育成熟并具有感染能力的原体颗粒可发生胞内胞吐，释放原体进入胞浆中，成为游离的原体。

网状体在吞噬空泡内进行二分裂增殖，增殖后的网状体可侵入棘阿米巴胞浆内，但不能继续增殖，而吞噬空泡内的网状体可继续指数增殖，产生大量子代，形成致密的包涵体。网状体在包涵体内逐渐发育成为原体或新月体，棘阿米巴滋养体的吞噬空泡体积增大，最终通过副衣原体的溶胞作用或者直接以胞吐方式释放出来。棘阿米巴副衣原体的溶胞作用受温度影响比较明显，在低于30℃时表现较低的水平，而在32℃～37℃时达到最大值。

感染的棘阿米巴滋养体体积增加，出现空泡样变化，可能是由于棘阿米巴副衣原体空泡的形成／或扩张；在培养后期，滋养体裂解，数量减少，大部分失去成囊活力，少部分轻度感染滋养体可形成包囊。据报道，Hall’s coccus株8h即可在多嗜棘阿米巴滋养体的吞噬空泡内发育成网状体；滋养体发生空泡样变化，可见分裂现象，胞浆内可见副衣原体包涵体，主要靠近细胞膜，呈瘤样或球状；滋养体体积增大，后期可见大部分滋养体裂解，数量减少；滋养体成囊率从99．6%下降至3%，囊内未发现存在副衣原体颗粒。在BN9株的研究中也发现，感染的多噬棘阿米巴滋养体的成囊能力下降，但在部分轻度感染的滋养体成囊后包囊内可发现副衣原体颗粒。

2．3 抗原结构 与衣原体相比，目前认为副衣原体的细胞壁中可能不具备脂多糖或N－末端截断型脂多糖（truncated LPS）；但副衣原体细胞壁上也含有一层蛋白质外膜，主要由几种多肽组成，称为主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP），它是决定其抗原性的主要物质基础。

在衣原体的研究中发现，MOMP的二级结构与穿孔蛋白（porin）一致，具有穿孔蛋白特性。外膜蛋白A（outer membrane proteinA，OmcA）、外膜蛋白B（outer membrane protein B，OmcB）同 MOMP一起构成外膜复合物（outer membrane complex，OMC）。这些蛋白质的多态性非常明显，从而决定了衣原体的多样性。

经二维电泳及质谱分析，棘阿米巴副衣原体UWE25株已经发现38个外膜蛋白，蛋白pc0978、pc0616和pc0617富含半胱氨酸，可能与副衣原体细胞外膜的稳定性相关；其中pc0616和pc0617分别与衣原体OmcB、OmcA具备较高的同源性。pc1489和pc1077蛋白在副衣原体外膜中含量极高，研究已经证明，pc1489作为特异性抗体，定位于棘阿米巴副衣原体外膜［23］，预测pc1489和pc1077的二级结构具备β－桶状（β－barrel）结构，类似穿孔蛋白，被认为是副衣原体的MOMP；这两种蛋白质与pc0978、pc0616和pc0617一起，构成了副衣原体的外膜复合物（图3）。

图2 棘阿米巴副衣原体发育周期1、副衣原体（原体及新月体阶段，紫色颗粒）与棘阿米巴（滋养体阶段）；2、棘阿米巴滋养体吞噬棘副衣原体；3、原体及新月体在棘阿米巴的吞噬空泡内体积增大形成网状体（黄色颗粒），进行二分裂增殖，形成致密的包涵体；4、网状体在包涵体内逐渐成熟为原体及新月体，棘阿米巴滋养体肿胀（4A），难以成囊（4B）；5、棘阿米巴副衣原体以原体、新月体（5A）及小囊泡（5B）的形式释放出来Fig．2 Developmental cycle of Parachlamydia acanthamoeba1：Parachlamydia （the elementary body and the crescent body，the purple particles）and Acanthamoeba（trophozoite）；2：Acanthamoebatrophozoites swallowed the Parachlamydia；3：The elementary and crescent body turned to reticulate body（the yellow particles）；4：The reticulate body turned to the elementary and crescent body，and the acanthamoebatrophozoites were difficult to turn to cysts；5：The Acanthamoebatrophozoites were split and the elementary and crescent body were released

图3 衣原体、副衣原体外膜基本结构模式图左图为衣原体外膜基本结构模式图，右图为副衣原体外膜基本结构预测图。Fig．3 The diagram about structure of outer membrane of Chlamydiaand ParachlamydiaLeft：The structure of outer membrane of Chlamydia；Right：The predicted structure of Parachlamydia

目前已知的副衣原体UWE25株细胞壁外膜上的MOMP与已知衣原体没有明显同源性；这也进一步说明副衣原体UWE25和衣原体在细胞壁成分之间存在明显的差异。

2．4 基因组结构与功能 目前只完成了副衣原体UWE25株全基因组测序（NC＿005861）。UWE25基因组全长2 414 465bp，是衣原体基因数的2倍；其中存在3kb的gap，G＋C含量为34．72%，比衣原体低得多；含有2 031个编码区（Coding Sequence，CDS），938个CDS与其他衣原体具有同源性，其中711个CDS为副衣原体与其他衣原体所共有，而1 093个CDS只存在于UWE25中；副衣原体拥有3个rRNA操纵子，其数量多于其他衣原体的rRNA操纵子。

棘阿米巴副衣原体含有丰富的亮氨酸重复序列，采集了大量的植物类基因，并含有一个变形杆菌起源的大型基因组岛Pam100G，包含有6个大型G＋C 富 集 基 因 （large GC－rich genes，IgrA，IgrB，IgrC，IgrD，IgrE，IgrF），它们很可能起源于一个独特的重复基因序列，与其他细菌未见任何同源性，在UWE25的生物学活性中发挥着重要的作用。由此可见，副衣原体的基因组远远大于其他衣原体的基因组，主要原因是其他衣原体生活在相对恒定的环境中（如真核细胞内），它们在进化过程中丢失了很多非必需的基因。

在 UWE25株基因岛（genomic islands，GIS）研究中发现另一个G＋C含量丰富的19kb的区域。这段序列是一个100kb的染色体的一部分，它包含100个高度保守的开放阅读框（open reading frame，ORF），两侧有两个17bp的重复序列，在这段遗传密码近段有两个相同的GLY－tRNA串联在一起；位于该染色体区域内有数个水平转移获得的基因，编码转座酶（transposases）及噬菌体相关蛋白，基本满足GIS的标准。G＋C含量分析表明，若干个序列组成这个基因组岛（genomic island，GI），其中一组基因编码了具有F－样结构的DNA结合转移系统，对F质粒的 DNA 接合传递 （traF，traG，traH，traN，traU，traW 及trbC）至关重要，说明副衣原体tra单位同样参与了DNA的接合传递。这种F质粒的接合传递最有可能发生在感染了副衣原体的棘阿米巴内，涉及到副衣原体之间的DNA传递；这可能是副衣原体与衣原体遗传学上的一个鉴别点；这些异源DNA很有可能是副衣原体从棘阿米巴的其他不同种的寄生物中获取的，该基因岛可能还是副衣原体一个重要致病物质。

同衣原体一样，UWE25的合成能力有限，不能合成核苷酸和电子载体NAD＋，只能通过一些特殊的渠道依靠宿主获取，但能合成一些有限的氨基酸（甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，天门冬酸，谷氨酰胺，谷氨酸和脯氨酸）和辅助因子（血红素，核黄素，叶酸和甲基萘醌类）等；这些特点证明了副衣原体专营寄生生活。

3 棘阿米巴副衣原体的分离培养

3．1 棘阿米巴中的副衣原体分离培养 副衣原体比较合适的自然宿主是棘阿米巴，极易与棘阿米巴共生，将其作为复制的载体，在棘阿米巴中复制增殖。迄今为止发现的8种副衣原体都寄生在人体或环境中的棘阿米巴中，因此副衣原体的培养主要依赖于棘阿米巴。目前可以从环境样本和临床标本检测和分离获得副衣原体，分离的样品包括鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、感染的角膜组织、脑组织和皮肤病灶、粥样硬化斑块和外周血单个核细胞等，以及污水、土壤等；分离棘阿米巴中的副衣原体主要有两种方法。

3．1．1 PYG分离培养：将环境样本或临床标本直接在蛋白胨酵母膏葡糖培养基（peptone yeast－extract glucose，PYG）中培养，PYG含有胰蛋白胨、酵母提取物及葡萄糖，营养丰富，必须添加双抗（β－内酰胺类和喹诺酮类抗生素）和两性霉素来去除污染。最佳生长温度为28℃，需培养数天或几周，培养过程中需要定期检查有无棘阿米巴分解或Gimenez阳性球菌的出现［8］。

3．1．2 PAS分离培养：将环境样本或临床标本直接接种在PAS（Page’s modified Neff’s amoeba saline）培养基中培养，再覆盖一层60℃热灭活1hr的大肠杆菌（棘阿米巴以灭活的大肠杆菌为食）。PAS是一种专门用于阿米巴培养的培养基，其特点是培养基中无营养成分，能抑制临床标本中污染物的过度生长，无须添加抗生素；于25～30℃培养，此法室温下可保种3个月，4℃可保种6～12个月。A－strid等对工业废水治理工厂中的活性淤泥（activated sludge）与未感染副衣原体的棘阿米巴标准株UWE1进行共同培养，成功获得一株新的副衣原体命名为UV－7。经鉴定UV－7的16SrRNA序列与UWE1的同源性为98．7%。

3．1．3 研究证实抗生素、温度和棘阿米巴状态对副衣原体的分离培养有影响。

（1）抗生素：副衣原体对β－内酰胺类抗生素和喹诺酮类是耐药的，而对庆大霉素较为敏感，使用此氨基甙类抗生素可阻碍副衣原体感染棘阿米巴；大环内酯类、四环素类抗生素、利福平及磺胺类药物等也会抑制副衣原体的生长，故不能在PYG培养基中添加上述抗生素。

（2）温度：棘阿米巴对生长条件的耐受性远大于其它营自生生活阿米巴（如纳氏虫属阿米巴），对干燥有较高抗性，对温度要求也不严格，可在20～37℃ 左右很好的存活，但是在培养含有副衣原体的棘阿米巴时，孵育期间的温度一般低于32℃，28℃是其最佳培养温度。高温下棘阿米巴非常容易形成包囊，而且在大于32℃的时候副衣原体易诱导阿米巴发生溶胞。冷冻可造成副衣原体的活力丧失，用液氮超低温保存的方法，细胞的复苏率极低，但添加2%～10% 胎牛血清可以减少失活率。

（3）宿主：副衣原体对外界的抵抗力主要源自于其寄生的棘阿米巴。一方面，它们的寄生宿主对温度、pH值、渗透压、消毒液以及抗生素等具有很强的耐受力，因此副衣原体对外界的抵抗力相对较强；另一方面，副衣原体与阿米巴的共生使它们互惠互利，副衣原体经过在阿米巴内的繁殖增强了传播能力、耐药性和致病性，同时也增强了自生生活阿米巴的抵抗力和致病性。

3．2 哺乳类细胞中的副衣原体分离培养 早期的研究认为副衣原体的宿主范围受棘阿米巴属限制，一般不用哺乳动物细胞培养副衣原体，但近来越来越多的实验证明副衣原体菌株能在多种细胞中存活；1994年Michel等首次利用等猴Vero细胞成功培养了副衣原体Berg17株，从而开拓了在实验室使用细胞培养副衣原体的新领域；Greub等发现副衣原体可以进入人体巨噬细胞，通过细胞内的大量复制，最后导致巨噬细胞凋亡［36］。体外细胞实验证实，副衣原体感染肺泡细胞（A549）和肺成纤维细胞（HEL），并在细胞内进行复制；副衣原体BN9株在HEp－2和Vero细胞中也能很好地存活；副衣原体UV－7株不受宿主棘阿米巴UWE1的限制，可入侵哺乳动物细胞，如Vero，Hela和NCI－H292细胞。同其他衣原体一样，棘阿米巴副衣原体利用ATP／ADP易位酶进行能量的转换。棘阿米巴副衣原体通过细胞内吞的途径进入人体巨噬细胞，并在其形成的吞噬空泡内进行大量复制，最后导致巨噬细胞的凋亡；副衣原体在巨噬细胞内的特征类似贝氏考克斯体（Coxiella burnetii）在内溶酶体内的特点，如呈酸性、溶酶体相关膜蛋白－1（Lamp－1）阳性及组织蛋白酶阴性；这些特点在本质上均不同于衣原体。

操作步骤包括棘阿米巴副衣原体样本分离、感染宿主细胞及共同培养3部分。

（1）梯度离心－反复冻融法从棘阿米巴中分离副衣原体网状体：感染副衣原体的棘阿米巴在PYG中32℃培养6d后，180×g离心10min去除棘阿米巴，取上清6 600×g离心30min后，PBS悬浮沉淀，加入含有10%蔗糖的PBS，4℃，5 800×g离心30min；不同浓度的泛影葡胺梯度超速离心后（140 000×g）收集棘阿米巴副衣原体，悬浮于PBS，在－80℃反复冻融两次备用。

（2）感染宿主细胞：副衣原体网状体经过DAPI（4，6－二脒基－2－苯基吲哚二盐酸盐，4′，6－diamidino－2－phenyl－indole，DAPI，DNA 荧光染料，可用于活细胞染色）染色后通过孔径0．25μm的硝酸纤维素膜过滤并计数，或用倍比稀释法计数。按1：1的比例，将宿主细胞与纯化的棘阿米巴副衣原体（可100℃灭活1h）在RPMI培养基中37℃培养8h后，用RPMI－肝素钠洗涤，继续培养，无须添加抗生素。

（3）共同培养：感染的细胞在35℃，5%CO2条件下，培养3～5d，每天用PBS洗涤后，取部分细胞用1%甲醛固定10min，Diff－Quik法染色后观察；也可培养3d后再进行DAPI染色观察。

4 展 望

作为一个新发现的病原体，棘阿米巴副衣原体的致病作用需要得到进一步证实；因副衣原体的遗传呈多样性，不同的菌种其致病性也各不相同，因此它们的种系发生关系也需要进一步阐明；由于副衣原体难以培养，目前迫切需要从临床标本和环境样本中成功分离出棘阿米巴副衣原体菌株和／或发现未知的且同源性较高的新种类。分离培养出棘阿米巴副衣原体菌株，并对其进行分子生物学及血清学等相关研究，对进一步阐明其种系发生关系、证实其致病性、明确其致病机制并进行快速诊断均具有十分重大的意义。

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