HPV16E7靶向小干扰RNA对SiHa细胞增殖凋亡及6种抑癌基因的影响

龙嘉 李黎明 许翠 杨佳 蒋明军

518035深圳大学第一附属医院 深圳市第二人民医院皮肤科（龙嘉）；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室（李黎明、许翠、杨佳、蒋明军）

HPV16E7靶向小干扰RNA对SiHa细胞增殖凋亡及6种抑癌基因的影响

龙嘉 李黎明 许翠 杨佳 蒋明军

518035深圳大学第一附属医院 深圳市第二人民医院皮肤科（龙嘉）；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室（李黎明、许翠、杨佳、蒋明军）

目的探讨HPV16E7在SiHa细胞株中对抑癌基因（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPARC、TFPI2）的表达及细胞增殖能力和凋亡水平的影响。方法SiHa细胞转染E7SiRNA 48 h后，qPCR检测E7及6种抑癌基因mRNA水平变化，CCK⁃8检测细胞增殖能力改变，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果SiHa细胞转染后48 h，qPCR结果显示实验组E7 mRNA显著降低（0.25±0.036，P＜0.05）；6种抑癌基因的mRNA水平均显著增加（MT1G 1.403±0.190、NMES1 1.720±0.060、RRAD 1.390±0.160、SFRP1 1.493±0.120、SPARC 2.157±0.144、TFPI2 2.060±0.122，P＜0.05）。细胞增殖结果显示，与阴性对照组及空白组比较，实验组细胞增殖能力显著降低（0.554±0.130，P＜0.05），阴性对照组和空白组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。细胞凋亡结果提示，实验组细胞凋亡细胞频率为9.222%较阴性对照组（0.246%）及空白组（0.123%）明显增加（P＜0.05），空白组与阴性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论HPV16导致细胞恶性转化过程中，E7可能通过抑制（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPAR、TFPI2）6种抑癌基因的表达参与作用。

人乳头瘤病毒16；乳头瘤病毒E7蛋白质类；细胞增殖；细胞凋亡；SiRNA；抑癌基因

人乳头瘤病毒（HPV）在多种肿瘤发生发展过程中的作用已得到广泛认同。高危型HPV感染是受染细胞发生恶性转化的必要条件，其中＞50%的HPV相关肿瘤与HPV16相关，因此针对HPV16的研究最为广泛，E6/E7基因是发挥致癌作用的主要分子，E6/p53⁃E7/pRB路径是致病的重要机制之一。越来越多的研究提示，除了上述途径之外，HPV16还可能通过其他途径直接或间接导致细胞恶性转化［1⁃3］。Sova等［4］通过生物芯片技术，分析HPV16阳性肿瘤细胞株，结果显示，23种基因的表达出现显著变化，其中，金属硫蛋白1G（metal⁃lothionein 1G，MT1G）、正常黏膜食管特异性蛋白1（normalmucosaofesophagus⁃specific 1gene，NMES1）、Ras相关GTP酶（ras⁃related GTPase gene，RRAD）、分泌型卷曲相关蛋白1（secreted frizzled⁃related protein 1 gene，SFRP1）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）、组织因子通路抑制剂2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2），6种基因表达显著降低，因而认为它们在肿瘤发展过程中发挥抑癌基因作用。高危型HPV的持续感染是细胞恶性转化的必要条件，我们推测这6种基因表达水平的降低可能与HPV16感染相关，但该研究结果尚未见报道。我们用HPV16E7小干扰RNA（SiRNA）沉默SiHa（HPV16阳性）细胞内的HPV16E7蛋白，研究沉默前后细胞的增殖及凋亡的变化，及上述6种基因表达的变化，为进一步研究相关基因的功能，深入探讨HPV 16致病机制奠定基础。

材料和方法

一、材料

1.材料：SiHa细胞株（本实验室保存），DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、OPTI⁃MEM（美国 Gibco公司）。Lipofectamin2000、Trizol®Reagent（美 国Invitrogen公司），Prime ScriptTMRT reagent Kit（日本 Takara公司），QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒（德国Qiagen公司），CCK⁃8试剂盒（日本同仁化学研究所），Annexin V⁃FITC凋亡检测试剂盒（美国eBioscience公司）。

2.SiRNA及PCR引物：由美国Invitrogen公司设计及合成HPV16 E7靶向SiRNA（序列为CAGAGGA GGAGGAUGAAAUAGAUGG），经Blastn（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）验证。使用Primer Premier 5.0设计HPV16E7、6种抑癌基因及β肌动蛋白的qPCR定量引物（表1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

二、方法

1.SiHa细胞培养及分组：复苏后于DMEM培养基（10%胎牛血清）培养细胞（37℃、5%二氧化碳），胰酶消化传代，3次传代后进行下一步实验。传代后SiHa细胞分为实验组、阴性对照组和空白组。实验组细胞转染E7 SiRNA，阴性对照组转染空载体，空白组未转染。

2.SiHa细胞转染及形态学观测：按Lipofectamin2000试剂盒说明书要求进行转染，将细胞接种至6孔板，转染前2 h更换OPTI⁃MEM无血清细胞培养基。将SiRNA或空载质粒（100 pmol）和Lipofectamine 2000（6 μl），分别加至 250 μl的无血清培养基中，室温静置5 min混匀2种悬液，室温静置20 min。最后将SiRNA混合液加至6孔板中，于37℃培养箱中培养。转染6 h后，更换为含血清培养基。用相差显微镜对转染后48 h的3个组SiHa细胞进行观察。

3.qPCR检测mRNA水平：

（1）RNA提取：洗涤转染细胞，每孔加1 ml Trizol试剂，细胞完全裂解后移至1.5 ml离心管，室温放置10 min。每管加入200 μl氯仿，混匀15 s，静置后离心。新微量离心管取上层水相，每管加入500 μl预冷异丙醇混匀，室温静置10 min后离心。每管加入1 ml 75%冰乙醇洗涤，室温自然干燥，将所得RNA溶于DEPC水中，备用。

表1 HPV16 E7、6种抑癌基因及β肌动蛋白的qPCR定量引物

（2）反转录：按说明书在无RNA酶的PCR管中配制如下反应体系：RNA样品1 μg，Mix 4 μl，水补充反应体系至20 μl。将反应体系轻混匀，将反应体系置入PCR仪，设置循环模式（37℃15 min，85℃5 s）。完成后所得cDNA于4℃保存备用。

（3）qPCR检测mRNA水平变化：Qu按antiFast SYBR GreenPCR试剂盒说明书要求于冰上在96孔板中配制如下反应体系：PCR Master Mix 10 μl，引物F/R各0.5 μl，cDNA 1 μl，双蒸水8 μl。分别加入96孔板，轻轻混匀。设置循环模式如下：50℃2 min；95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s（40个循环）；95℃15 s，60 ℃ 60 s，5 ℃ 15 s。

4.增殖活性检测：按CCK⁃8试剂盒说明操作，分组方法参照上述实验分组，各组均设3个复孔。于96孔板中每孔加入5×103个细胞，定容至100 μl，培养过夜。次日进行转染（方法同前）。转染后48 h每孔加入10 μl CCK⁃8试剂，继续培养1 h。后用紫外分光光度仪检测每孔450 nm波长的吸光度A值。

5.细胞凋亡检测：按Annexin V⁃FITC凋亡检测试剂盒说明书操作。取转染后48 h细胞，将原细胞培养液吸出至干净离心管内。洗涤贴壁细胞后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞1～2 min。加入之前收集的原细胞培养液，吹打使之形成单细胞悬液。移至15 ml离心管，离心后弃上清，用PBS重悬细胞并计数。取5×104个重悬的细胞，离心后弃上清，加入195 μl Annexin V⁃FITC结合液后加入5 μl Annexin V⁃FITC混匀。室温避光孵育10 min，离心后弃上清。加入190 μl Annexin V⁃FITC结合液及10 μl碘化丙锭染色液，混匀后避光放置。随即用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

6.统计学方法：实验结果取3次重复均值。用SPSS16.0软件进行统计学分析。数据以±s表示，用单因素方差分析分析组间的显著性。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、转染后细胞形态

倒置光学显微镜下可见转染前细胞生长状态良好，多数细胞贴壁生长，细胞形态呈梭形或星形（图1A）；转染48 h后，3个组间细胞贴壁情况无明显差别，但实验组（图1B）及阴性对照组（图1C）细胞胞质内出现大量空泡，空白组（图1D）未见明显空泡。另实验组细胞汇合度较阴性对照组及空白组（图1D）低，大量细胞形态由梭形或星形变为圆形。

二、qPCR检测mRNA表达变化

为进一步明确SiRNA干扰效果、对E7表达的影响，以及E7沉默后对6种抑癌基因的影响，我们用qPCR对3个组细胞中相关基因的mRNA表达水平进行分析。实验结果显示（图2），与阴性对照组（0.963±0.040）及空白组（0.990±0.017）相比，实验组E7 mRNA显著降低（0.25±0.036，P＜0.05）；6种抑癌基因的mRNA水平均显著增加（MT1G 1.403±0.190、NMES1 1.720 ± 0.060、RRAD 1.390 ± 0.160、SFRP1 1.493 ± 0.120、SPARC 2.157 ± 0.144、TFPI2 2.060±0.122，P＜0.05），阴性对照组和空白组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

三、检测转染后细胞增殖情况

转染后48 h，收集3个组SiHa细胞，利用CCK⁃8试剂分析细胞增殖情况（图3）。与阴性对照组及空白组相比较，实验组细胞增殖显著降低（0.554±0.130）（P＜0.05）。阴性对照组（1.028±0.236）和空白组（1.220±0.126）之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 转染前后SiHa细胞生长状态（倒置光学显微镜×400） 1A：转染前，细胞形态呈梭形或星形；1B：实验组（转染siRNA 48 h后），胞质内出现大量空泡；1C：阴性对照组（转染空载体后48 h），胞质内出现大量空泡；1D：空白组（未转染、连续培养48 h后）未见明显空泡

四、细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡频率（图4）。结果提示，3个组细胞凋亡的频率均较低，但实验组细胞凋亡频率为9.222%较实验组及空白组显著增加（P＜0.05），空白组与阴性对照组凋亡频率分别为0.246%及0.123%，差异无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

图2 转染后48 h，qPCR分析mRNA表达水平

图3 转染后48 h细胞增殖情况

RNA干扰在细胞体内对于基因的调控以及防御外界病毒的入侵起到了重要作用，主要是通过促进相关mRNA降解而达到使基因沉默的结果［5］。E6/p53⁃E7/pRB路径是HPV16导致细胞恶性转化的重要路径之一，其中E7与pRB蛋白结合使转录因子E2F被释放，后者激活基因转录，促进了众多细胞增殖相关基因的转录，从而导致细胞凋亡受抑制及细胞恶性转化［6⁃7］。但近年的研究表明，HPV16E7除了通过E7/pRB途径导致细胞恶性转化及肿瘤的发生外，还可通过其他途径直接或间接导致肿瘤的形成。如E7可以和其他RB相关的pocket蛋白结合，如p107及p130等，导致这些蛋白通过泛素途径降解［8］。此外E7蛋白基因的表达还可导致多种细胞周期负向调控信号失效，如TGF⁃β介导的生长抑制、p16介导的细胞周期停滞、p21和p27介导的G1/S转换阻滞等［9］。

Sova等［4］利用HPV16阳性肿瘤细胞株及相关临床标本，采用生物芯片测序等技术，得出MT1G，NMES1，RRAD，SFRP1，SPARC和TFPI2基因与肿瘤的发生和形成密切相关，这6种基因均为高甲基化，mRNA表达降低，发挥抑癌基因功能。我们推测HPV16 E7可能与上述抑癌基因高甲基化导致的表达降低有关，因此我们用E7靶向SiRNA沉默SiHa细胞株中的E7，研究沉默前后上述6种抑癌基因的表达、细胞生长状况及细胞凋亡情况的变化，以期进一步研究E7的功能。

本实验结果表明，E7 SiRNA可以成功导致HPV16 E7mRNA表达降低75%左右。与此同时，发现6种抑癌基因的mRNA水平均明显升高，与阴性对照组及空白组有显著差异。该结果提示，HPV16 E7与抑癌基因的低表达相关，但其作用机制尚需进一步研究。我们推测E7可能与甲基化酶发生直接或间接的作用，使得这些基因的甲基化水平升高，进而导致其mRNA表达降低。HPV16阳性肿瘤细胞系需要通过不断增殖且保持抗凋亡性以维持细胞恶性状态［10］。在一些病毒相关肿瘤，抗细胞凋亡的活动通常来自病毒蛋白［11］。因此，我们通过CCK⁃8检测增殖活性改变，并且通过流式细胞仪检测转染后细胞凋亡改变。实验结果表明，实验组肿瘤细胞的增殖活性较阴性对照组及空白组明显下降，凋亡水平较阴性对照组及空白组明显升高。进一步说明E7可以促进细胞增殖维及抑制细胞凋亡，从而维持肿瘤细胞恶性状态。

图4 转染后48 h流式细胞仪分析细胞凋亡频率 4A：实验组；4B：阴性对照组；4C：空白组

本研究的结果表明，HPV16E7不仅可以导致靶细胞的增殖和凋亡发生改变，而且可导致抑癌基因的mRNA表达均降低。HPV 16是否通过与DNA甲基化酶的直接和或间接的作用，使目的基因的甲基化水平升高，mRNA表达降低，进而发挥HPV 16的致病功能，尚待进一步研究。

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（本文编辑：吴晓初）

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Effects of a small interfering RNA targeting HPV16E7 on proliferation and apoptosis of SiHa cells and expressions of six tumor suppressor genes

Long Jia,Li Liming,Xu Cui,Yang Jia,Jiang Mingjun
Department of Dermatology,Shenzhen Second People's Hospital,The First Affiliated Hospital of Shenzhen University，Shenzhen 518035,China（Long J）;Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China（Li LM,Xu C,Yang J,Jiang MJ)

ObjectiveTo evaluate effects of human papilloma virus（HPV）16E7 on expressions of six tumor suppressor genes（including MT1G,NMES1,RRAD,SFRP1,SPARC and TFPI2）in a cell line SiHa,as well as on its proliferation and apoptosis.MethodsSiHa cells were divided into two groups to be transfected with a small interfering RNA targeting HPV16E7（E7SiRNA,experimental group）and an empty vehicle（negative control group）respectively,with SiHa cells receiving no treatment serving as the blank control group.After 48 hours,qPCR was performed to measure the mRNA expressions of E7 and six tumor suppressor genes,CCK⁃8 assay to evaluate cellular proliferative activity,and flow cytometry to assess apoptosis of SiHa cells.ResultsAt 48 hours after the transfection,the experimental group showed significantly decreased E7 mRNA expression（0.25±0.036,P＜ 0.05）,but increased mRNA expressions of the six genes（MT1G 1.403±0.190,NMES1 1.720±0.060,RRAD 1.390±0.160,SFRP1 1.493±0.120,SPARC 2.157±0.144,TFPI2 2.060±0.122,allP＜0.05）.The proliferative activity of SiHa cells was significantly decreased（0.554±0.130vs.1.028±0.236 and 1.220±0.126,bothP＜0.05）,but the apoptosis rate was significantly increased（9.222%vs.0.246%and 0.123%,bothP＜ 0.05）in the experimental group compared with the negative control group and blank control group.No significant differences were observed between the negative control group and blank control group in proliferative activity or apoptosis rate of SiHa cells（bothP＞ 0.05）.ConclusionE7 may participate in HPV16⁃induced cellular malignant transformation by suppressing the mRNA expressions of 6 tumor suppressor genes,including MT1G,NMES1,RRAD,SFRP1,SPAR and TFPI2.

Human papillomavirus 16;Papillomavirus E7 proteins;Cell proliferation;Apoptosis;SiRNA;Tumor suppressor genes

Jiang Mingjun,Email:drmingjunjiang@163.com

2016⁃03⁃02）

蒋明军，Email：drmingjunjiang@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.10.009

国家自然科学基金（31470274）；江苏省临床医学研究中心项目（BL2012003）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（2016RC310025）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31470274）;Clinical Research Center Program of Jiangsu Province（BL2012003）;Special Fund for Basic Scientific Research Business of Central Public Research Institutes（2016RC310025）