特应性皮炎患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性变化及其意义

梁颖红 魏明 涂玲 刘佳 龚艳杰 张宜花

450052郑州大学附属第五临床学院检验科

特应性皮炎患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性变化及其意义

梁颖红 魏明 涂玲 刘佳 龚艳杰 张宜花

450052郑州大学附属第五临床学院检验科

目的 观察特应性皮炎（AD）患者外周血T淋巴细胞中Rho激酶活化情况，分析其临床意义。方法 收集60例AD患者和60例健康儿童外周肝素抗凝血8 ml，分离提取T细胞和血清。分别用AD血清和健康对照血清培养AD患者T细胞或健康对照T细胞，分为患者T细胞+自身血清组、患者T细胞+健康对照血清组、健康对照T细胞+自身血清组、健康对照T细胞+AD血清组。此外，分别用Rho激酶特异性抑制剂Y27632（Y27632组）、CD3/CD28单抗（CD3/CD28单抗组）、Y27632+CD3/CD28单抗（Y27632+CD3/CD28单抗组）处理AD患者T细胞，自身血清培养AD患者T细胞为患者T细胞组。采用Western印迹法检测各组Rho激酶活性，四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测T细胞增殖活性，ELISA检测白细胞介素（IL）6、IL-10水平。结果新鲜分离的AD患者外周血T细胞Rho激酶活性（2.47%±0.89%）显著高于健康对照组（0.65%±0.35%，t=2.729，P＜0.05）。AD患者T细胞在体外经10%胎牛血清培养24 h后Rho激酶活性（0.70%±0.38%）较培养前显著降低（t=2.658，P＜0.05），但与培养24 h后健康对照T细胞（0.63%±0.32%）相比，差异无统计学意义（t=1.010，P＞0.05）。与健康对照血清培养T细胞相比，AD血清培养T细胞会增加Rho激酶活性（F=8.22，P＜0.001），患者T细胞+自身血清培养24 h后Rho激酶活性（2.41%±0.87%）明显高于患者T细胞+健康对照血清组（0.76%±0.41%），健康对照T细胞+AD血清组（2.17%±0.85%）显著高于健康对照T细胞+自身血清组（0.64%±0.33%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。Y27632可显著抑制AD患者T细胞的增殖和IL-6的分泌（F=18.68、22.95，P＜0.001），Y27632组T细胞增殖率、IL-6的表达均显著低于患者T细胞组（均P＜0.05），且Y27632+CD3/CD28单抗组也显著低于CD3/CD28单抗组（均P＜0.05），而Y27632对AD患者T细胞IL-10分泌无显著影响。结论 AD患者T淋巴细胞存在Rho激酶信号活化异常，提示Rho激酶信号异常在AD发病过程中可能发挥着一定的作用。

皮炎，特应性；T淋巴细胞；rho相关激酶类；信号传导；白细胞介素6；白细胞介素10

在特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）的发病机制中，T细胞活化可能起着关键性的作用［1-3］，活化的T细胞通过分泌细胞因子和（或）细胞间相互接触等方式启动B细胞多克隆活化和扩增，导致高球蛋白血症和自身抗体过度产生，参与局部炎症反应。研究［4-7］发现，T细胞中存在多种信号蛋白活性异常，并且这些异常的信号蛋白可能参与了AD的发病机制。Rho激酶（Rho kinase）是小分子鸟嘌呤核苷（GTP）酶Rho A信号下游的一个关键性蛋白，不仅参与调节细胞骨架形成、迁移等细胞活动，而且对细胞增殖、免疫炎症反应也有重要的调控作用［8-10］。据文献［11］报道，Rho 激酶特异性抑制剂 Y27632能显著抑制人外周T细胞分泌白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等细胞因子，提示Rho激酶可能参与T细胞活化。但Rho激酶是否参与AD的发病机制目前尚不清楚。为此，我们观察了AD患者外周血T细胞Rho激酶活性，探讨其临床意义。

对象与方法

一、对象

2011年10月至2014年12月就诊于我院门诊的AD患者60例，全部符合Williams特应性皮炎诊断标准［12］，其中男 24例，女 36例，年龄 5～14（10.0±4.6）岁。所有患者均无其他明显皮肤病变、自身免疫性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、呼吸系统疾病、肝病和肿瘤等病史，且停用抗组胺药2周以上，停用系统及局部糖皮质激素及其他免疫抑制剂1个月以上。健康对照组60例来自儿保科健康体检者，其中男26例，女34例，年龄 5～14（10.0±4.5）岁，无家族过敏史，无明显皮肤病变或内脏疾病史。两组受试者性别、年龄差异无统计学意义。本实验经医院伦理委员会批准，儿童法定监护人均签署知情同意书。

二、方法

1.材料和试剂：RosettSep T细胞提取试剂盒（加拿大Stemcell Technologies公司），含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），抗CD3单抗（美国BD Pharmingen公司），CD3单抗、CD28单抗（美国BD Biosciences公司），Rho激酶特异性抑制剂Y27632（美国Chemicon公司），1∶500磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（MYPT-1）、1∶2 000辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG（美国Santa Cruz公司）。十二烷基硫酸钠（SDS）样本裂解缓冲液A由50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、10 mmol/L MgCl2、500 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、0.5%去氧胆酸钠、0.1%SDS、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、10 mg/L亮抑肽酶、10 mg/L抑肽酶配制而成。

2.标本收集及外周血T细胞分离：抽取AD患者和健康对照组儿童外周静脉血8 ml，均分装2管。一管5 ml抗凝血用于T细胞分离，采用RosettSep T细胞提取试剂盒分离T淋巴细胞，然后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬，调整T细胞密度1×109，分别把悬液置于 96孔板（100 μl/孔），37℃、5%CO2孵箱中培养24 h，用抗CD3单抗在流式细胞仪上检测T细胞纯度，均在95%以上。采用免疫印迹法检测AD患者和健康对照组外周血T细胞培养前后Rho激酶活性。另一管3 ml血液1 500×g离心5 min，吸取上清液，分装储存于－80℃待用。

3.AD患者血清对T细胞的影响：使用前，AD患者和健康对照血清均在56℃灭活30 min，然后离心除去沉淀物。随机将血清和T细胞分为患者T细胞+自身血清组、患者T细胞+健康对照血清组、健康对照T细胞+自身血清组、健康对照T细胞+AD血清组，培养24 h后，检测各组Rho激酶活性。

4.免疫印迹法检测Rho激酶活性：提取各组T细胞总蛋白：用冷1×PBS洗涤T细胞1次，加入50 μl SDS样本裂解缓冲液A，匀浆后置冰上，超声粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上；4℃1 600×g离心5 min，吸取上清液，分装储存于-20℃。采用免疫印迹法检测磷酸化MYPT-1蛋白表达（用磷酸化MYPT-1蛋白表达来表示Rho激酶活性）。取50 μl T细胞总蛋白上样于15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，用转移缓冲液把凝胶上蛋白质转移至醋酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h。然后膜与I抗（1∶500磷酸化MYPT1）于4℃孵育过夜，β肌动蛋白（1∶2 000）为内参，后在室温下与Ⅱ抗（1∶2 000辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG）孵育1 h，TBST洗膜后，用ECL液显影，最后用KODAKID型凝胶成像分析系统对结果进行图像分析，Rho激酶活性=磷酸化MYPT-1A值/β肌动蛋白A值。

5.Y27632对AD患者T细胞的影响：将已分离的部分AD患者T细胞分为患者T细胞组（不进行任何处理）、CD3/CD28单抗组（用5 mg/L CD3单抗和5 mg/L CD28单抗处理AD患者T细胞）、Y27632组（用 10 μmol/L Y27632处理 T细胞）、CD3/CD28单抗+Y27632组（先用Y27632处理T细胞，再用CD3/CD28单抗刺激）。处理48 h后，提取各组T细胞总蛋白，检测各组T细胞增殖活性和T细胞培养上清液中IL-6和IL-10水平。采用噻唑蓝（MTT）法测定T细胞增殖活性，MTT法具体步骤参见文献［13］。按ELISA试剂盒步骤检测T细胞培养上清液中IL-6和IL-10水平。

6.统计学处理：临床资料采用Excel建立数据库，采用SPSS13.0统计软件包进行数据分析；计量资料以±s表示，两组比较采用独立样本t检验，同组处理前后的比较用配对t检验，另行两因素析因设计方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、AD患者外周血T细胞培养前后Rho激酶活性变化

新鲜分离的AD患者外周血T细胞Rho激酶活性（2.47%±0.89%）显著高于健康对照组（0.65%±0.35%），差异有统计学意义（t=2.729，P＜0.05）。外周血T细胞经10%胎牛血清培养24 h后，AD患者外周血T细胞Rho激酶活性（0.70%±0.38%）较培养前显著降低（t=2.658，P＜0.05），但与培养24 h后健康对照组（0.63%±0.32%）相比，差异无统计学意义（t=1.010，P＞0.05）。见图1。

二、AD患者血清对T细胞Rho激酶活性的影响

T细胞与血清培养24 h后，患者T细胞+自身血清组Rho激酶活性（2.41%±0.87%）明显高于患者T细胞+健康对照血清组（0.76%±0.41%），也显著高于健康对照T细胞 +AD血清组（2.17%±0.85%）（P＜0.05）；健康对照T细胞+AD血清组明显高于健康对照T细胞+自身血清组（0.64%±0.33%），差异均有统计学意义（P＜0.05）；AD患者T细胞+健康对照血清组高于健康对照T细胞+自身血清组（P＜0.05）。析因设计方差分析示，与健康对照血清培养T细胞相比，AD血清培养T细胞会增加Rho激酶活性（F=8.22，P＜0.001），AD 患者 T细胞Rho激酶活性高于健康对照T细胞（F=12.21，P＜0.001），细胞与血清存在交互作用（F=11.81，P＜ 0.001）。见图2。

图1 特应性皮炎（AD）患者及健康对照者外周血T细胞磷酸化MYPT-1蛋白表达 1：培养前健康对照组；2：培养前AD患者组；3：培养24 h后健康对照组；4：培养24 h后AD患者组

图2 特应性皮炎（AD）患者血清对T细胞磷酸化MYPT-1蛋白表达的影响 1：患者T细胞+对照血清组；2：健康对照T细胞+对照血清组；3：患者T细胞+AD血清组；4：健康对照T细胞+AD血清组

三、Y27632对AD患者T细胞增殖的影响

单独效应分析，Y27632组患者T细胞增殖率显著低于患者T细胞组（P＜0.05），且Y27632+CD3/CD28单抗组也显著低于CD3/CD28单抗组（P＜0.05）。CD3/CD28单抗组显著高于患者T细胞组（P＜ 0.05），Y27632+CD3/CD28单抗组亦高于Y27632组（P＜0.05），见表1。析因设计方差分析示，Y27632可显著抑制AD患者T细胞的增殖（F=18.68，P＜0.001），而 CD3/CD28单抗可显著促进 AD患者T细胞的增殖（F=13.35，P＜0.001），Y27632与CD3/CD28单抗存在交互作用（F=15.39，P＜0.001）。

四、Y27632对AD患者T细胞分泌细胞因子的影响

析因设计方差分析示，Y27632可显著抑制AD患者T细胞IL-6的分泌（F=22.95，P＜0.001），而CD3/CD28单抗可显著促进IL-6的分泌（F=13.26，P＜0.001），Y27632与 CD3/CD28单抗存在交互作用（F=18.67，P＜0.001）。单独效应分析，Y27632组IL-6的表达显著低于患者T细胞组（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28单抗组IL-6的表达显著低于CD3/CD28单抗组（P＜0.05）。CD3/CD28单抗组IL-6的表达高于患者T细胞组（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28单抗组IL-6的表达亦高于Y27632组（P＜0.05）。此外，CD3/CD28单抗可显著促进IL-10的分泌（F=14.68，P＜0.001），CD3/CD28单抗组 IL-10的表达高于患者T细胞组（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28单抗组IL-10的表达亦高于Y27632组（P＜0.05）；然而，Y27632对AD患者T细胞IL-10的分泌无明显作用（F=1.13，P＞0.05）。见表1。

表1 Rho激酶特异性抑制剂Y27632对特应性皮炎（AD）患者T细胞增殖活性、IL-6和IL-10分泌的影响（±s）

表1 Rho激酶特异性抑制剂Y27632对特应性皮炎（AD）患者T细胞增殖活性、IL-6和IL-10分泌的影响（±s）

注：a：与患者 T 细胞组相比，P ＜ 0.05；b：与 CD3/CD28 单抗组相比，P ＜ 0.05；c：与Y27632组相比，P＜0.05

组别 例数 T细胞增殖率（%） IL-6（ng/L） IL-10（ng/L）患者T细胞组 60 102±35 389±72 112±27 Y27632组 60 51±17a 130±25a 92±23 CD3/CD28单抗组 60 228±65a 712±126a 291±56a Y27632+CD3/CD28单抗组 60 136±38bc 378±77bc 273±48c

讨 论

Rho家族蛋白是小分子GTP酶，具有广泛的生物学功能，特别在调节细胞迁移、增生、黏附、免疫反应等方面有重要作用。作为RhoA下游关键性信号蛋白，Rho激酶在转导Rho信号通路活化方面起重要作用［14］，MYPT-1是 Rho激酶重要的底物，能反应 Rho 激酶的活性［15］。有研究［16］发现，RhoA/Rho 激酶信号通路活化参与调控健康人外周血单核细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子。Segain等［17］发现，活动性克罗恩病患者炎症部位肠黏膜RhoA和Rho激酶活性显著高于健康对照组。本研究结果显示，AD组外周血T细胞Rho激酶活性明显高于对照组，同时，Rho激酶特异性抑制剂Y27632能抑制患者外周血T淋巴细胞分泌IL-6，但对IL-10的分泌没有显著的抑制作用。可能Rho激酶通过影响T淋巴细胞的增殖，参与AD患者的炎性因子的调控。但有关Rho激酶在AD发病机制中的具体作用及其意义仍有待进一步研究。

本研究中AD患者T细胞经体外10%胎牛血清孵育24 h后，原本增高的Rho激酶活性却降至正常水平，同时AD患者T细胞与健康对照组血清培养后，T细胞Rho激酶活性也显著下降，而健康对照组T细胞与AD患者血清培养后其T细胞Rho激酶活性明显增高。上述结果提示，AD患者外周血T细胞中异常增高的Rho激酶活性可能是继发性的，可能与其血清中存在某种“致病”因素有关。这与其他研究者发现SLE患者T细胞ERM信号通路异常活化的结果相类似［18］。动物实验发现，IL-17能够显著上调变应性接触性皮炎（ACD）皮肤模型的炎性因子表达，IL-17可通过诱导角质形成细胞增生和活化，刺激黏附分子的表达和上调下游细胞因子［19］。

T细胞的“病理性”活化通过分泌细胞因子（如IL-6）或细胞间的相互作用，参与了局部炎症反应［20］。本研究结果显示，Rho激酶特异性抑制剂Y27632显著抑制AD患者T细胞增殖和分泌IL-6，提示AD患者外周血T细胞中Rho激酶可能参与其体内T细胞的内在活化。由于AD是慢性炎症性皮肤病，病情迁延反复，推测外周血中T细胞的黏附和迁徙能力的强弱对T细胞能否迁徙并在局部浸润起关键性的作用。因此，Rho激酶通路很可能是调节AD患者T细胞活化和在局部浸润的重要靶点，通过抑制该通路活性可能有利于AD的治疗。

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Changes of Rho kinase activity in peripheral blood T lymphocytes from patients with atopic dermatitis and their significance

Liang Yinghong,Wei Ming,Tu Ling,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Yihua
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo evaluate changes of Rho kinase（ROK）activity in peripheral blood T lymphocytes from patients with atopic dermatitis （AD）,and to analyze their clinical significance.MethodsEight milliliters of heparin-anticoagulated blood samples were collected from 60 patients with AD and 60 healthy human controls followed by separation of T lymphocytes and sera from these blood samples as well as culture of isolated T lymphocytes with 10%fetal bovine serum for 24 hours.Both patient-and control-derived T lymphocytes were classified into two groups to be cultured with patient-or control-derived sera.In addition,some patient-derived T lymphocytes were classified into 4 groups:Y27632 group treated with the Rho kinase-specific inhibitor Y2763,CD3/CD28 group treated with anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies,Y27632+CD3/CD28 group treated with Y27632 and anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies,and control group treated with patient-derived sera.Subsequently,Western-blot analysis was performed to evaluate ROK activity in cells,methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay to evaluate proliferative activity of T lymphocytes,and ELISA to measure interleukin 6 （IL-6）and IL-10 levels in supernatants of T lymphocytes.ResultsROK activity was significantly lower in fresh T lymphocytes from patients than in those from healthy controls（2.47%±0.89%vs.0.65%±0.35%,t=2.729,P＜ 0.05）.After 24-hour culture with 10%fetal bovine serumin vitro,ROK activity was significantly decreased in patient-derived T lymphocytes compared with those before culture（0.70%±0.38%vs.2.47%±0.89%,t=2.658,P＜0.05）,but no significant difference was observed between patient-and control-derived T lymphocytes（0.70% ± 0.38%vs.0.63% ±0.32%,t=1.010,P＞0.05）.Compared with T lymphocytes cultured with control-derived sera,those cultured with patient-derived sera showed significantly increased ROK activity（F=8.22,P＜0.001）.Concretely speaking,ROK activity was significantly higher in patient-derived T lymphocytes cultured with patient-derived sera than in those cultured with control-derived sera（2.41%±0.87%vs.0.76% ±0.41%,P＜0.05）,and higher in control-derived T lymphocytes cultured with patient-derived sera than in those cultured with control-derived sera（2.17% ±0.85%vs.0.64%±0.33%,P＜0.05）at 24 hours.Y27632 could significantly inhibit the proliferation of as well as secretion of IL-6（F=18.68,22.95,respectively,bothP＜ 0.001）by patient-derived T lymphocytes,but had insignificant effects on secretion of IL-10.The cellular proliferative activity and IL-6 supernatant level were significantly lower in the Y27632 group than in the control group,and lower in the Y27632+CD3/CD28 group than in the CD3/CD28 group （allP＜0.05）.ConclusionAberrant activation of ROK exists in T lymphocytes from patients with AD,which may play a certain role in the pathogenesis of AD.

Dermatitis,atopic;T-lymphocytes;rho-Associated kinases;Signal transduction;Interleukin-6;Interleukin-10

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.007

2015-05-18）

（本文编辑：周良佳 颜艳）