磷酸化c-Jun氨基末端激酶和P38丝裂原活化蛋白激酶在寻常性银屑病皮损中的表达

葛新红 唐真真 焦亚宁 吴昊 喻楠 董灵娣 李乐 杨彪 蒲小霞

750004银川，宁夏医科大学总医院皮肤科（葛新红、焦亚宁、喻楠、董灵娣、李乐）；山东省兰陵县人民医院皮肤科（唐真真）；宁夏医科大学（吴昊、杨彪、蒲小霞）

磷酸化c-Jun氨基末端激酶和P38丝裂原活化蛋白激酶在寻常性银屑病皮损中的表达

葛新红 唐真真 焦亚宁 吴昊 喻楠 董灵娣 李乐 杨彪 蒲小霞

750004银川，宁夏医科大学总医院皮肤科（葛新红、焦亚宁、喻楠、董灵娣、李乐）；山东省兰陵县人民医院皮肤科（唐真真）；宁夏医科大学（吴昊、杨彪、蒲小霞）

目的 探讨磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）和P38丝裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）在寻常性银屑病皮损中的表达。方法 收集30例确诊的寻常性银屑病患者皮损，同时收集30例健康人皮肤组织作为对照组。采用免疫组化及Western印迹法分别检测p-JNK和p-P38MAPK蛋白在寻常性银屑病皮损组织和正常人皮肤中的表达情况。结果 免疫组化结果显示，寻常性银屑病皮损组织p-JNK和p-P38MAPK表达的平均吸光度（AOD）值分别为0.663±0.016和0.436±0.011，均明显高于对照组（0.333±0.009和0.306±0.010），差异有统计学意义（t=44.869、21.913，均P＜0.001）。Western印迹法同样显示，寻常性银屑病皮损p-JNK和p-P38MAPK蛋白相对表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（t值分别为20.477和165.084，均P＜0.05）。结论 JNK和P38MAPK的活化可能参与了寻常性银屑病表皮细胞的过度增殖。

银屑病；JNK丝裂原活化蛋白激酶类；p38丝裂原活化蛋白激酶类；c-Jun氨基末端激酶

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，MAPK 有3个主要家族成员——细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2），c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）及P38丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK），该通路被激活后经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子，激活基因的转录，指导细胞增殖、分化、凋亡等。银屑病是一种以表皮过度增殖为主要特征的慢性炎症性皮肤病，研究发现，磷酸化ERK1/2及其上游激活因子表皮生长因子受体（EGFR）和下游转录因子Elk-1在寻常性银屑病皮损中的表达增强［1］，但JNK2和P38MAPK在寻常性银屑病发病中的激活状态尚不清楚。本文旨在从蛋白水平研究MAPK中磷酸化 JNK（p-JNK）、P38MAPK（p-P38MAPK）在寻常性银屑病中的表达，以探讨JNK和P38MAPK在寻常性银屑病发生中的作用。

对象与方法

一、对象

2013年8月至2014年9月就诊于宁夏医科大学总医院皮肤科、经临床和病理确诊的寻常性银屑病患者30例，其中男18例，女12例，年龄13～62（29.8±4.15）岁，病程2个月至11年。纳入标准：银屑病面积和严重程度指数（PASI）≥10及皮损面积＞10%的中、重度稳定期寻常性银屑病患者；取皮肤标本前1个月内未服用过糖皮质激素、免疫抑制剂、维A酸类药物及其他系统治疗药物，1个月内未外用治疗银屑病的药物；不伴有其他类型皮肤病、肿瘤或其他严重疾患。同时收集本院皮肤整形外科手术的30份正常皮肤组织作为对照组，男16例，女14例，年龄15～59（27.9±3.32）岁。患者组和对照组在性别、年龄分布上差异无统计学意义（P＞0.05），且取材部位上相匹配。寻常性银屑病标本取自躯干典型皮损，沿皮纹走向行梭形切口（1cm×0.5cm）。所有组织标本均分为两部分，一部分用液氮速冻，-80℃冰箱保存，用于Western印迹法检测；另一部分用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，用于免疫组化染色。本研究经过宁夏医科大学总医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

二、主要试剂

＃4668兔抗人单克隆抗体 p-JNK（Thr183/Tyr185位点）、＃4511p-P38MAPK（Thr180/Tyr182位点）（美国Cell Signaling Technology公司），DAB显色试剂盒、PV-6001试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），NC膜（德国Schleicher&Schuell公司），内参GAPDH（杭州贤至生物科技有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。

三、实验方法

1.免疫组化染色：常规二步法，4 μm厚切片，常规脱蜡，修复，3%H2O2孵育10 min，分别加入稀释的一抗：p-JNK（1 ∶50）、p-P38MAPK（1 ∶1 600），4 ℃过夜，滴加二抗室温孵育1 h，DAB显色、复染、封片。选择乳腺癌标本作阳性对照，PBS作为阴性对照。利用图像采集系统400倍下连续拍照，Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，每张切片随机选取10个高倍视野（×400），测定阳性区域图像的积分吸光度（IOD）值。平均吸光度（AOD）值=IOD值/面积。

2.Western印迹法：提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，经10%SDS丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至NC膜上。将NC膜浸入5%BSA封闭液，于室温置摇床平缓摇动1 h；加一抗4℃孵育过夜，二抗室温置摇床平缓摇动1 h，中间均用TBST漂洗5 min×5次。化学发光，曝光，显影，定影；凝胶成像系统拍照，经Gel-Pro analyzer分析系统对目的显色条带进行吸光度（A值）分析和扫描，观察各实验组泳道膜上棕黑色目的蛋白带密度灰度，以内参GAPDH作为参照。

四、统计学方法

结 果

一、免疫组化检测寻常性银屑病皮损和对照组皮肤p-JNK和p-P38MAPK的表达

p-JNK在对照组皮肤表皮的个别细胞核中有少量淡黄色表达，而在寻常性银屑病皮损表皮全层细胞的细胞核和细胞质中呈深棕色表达，在个别淋巴细胞胞核上也有表达。见图1。寻常性银屑病皮损组织p-JNK的相对表达量明显高于对照组，两组差异有统计学意义。见表1。

p-P38MAPK的表达主要定位于细胞核，在正常对照皮肤表皮细胞核中有少量表达，呈浅棕色，而在寻常性银屑病皮损表皮全层细胞的细胞核中有大量表达，呈深棕色。见图1。寻常性银屑病皮损组织p-P38MAPK的相对表达量明显高于对照组，两组差异有统计学意义。见表1。

二、Western印迹法检测寻常性银屑病皮损和正常对照皮肤p-JNK和p-P38MAPK的表达

寻常性银屑病皮损与正常对照皮肤均有p-JNK和p-P38MAPK的表达，且寻常性银屑病皮损p-JNK和p-P38MAPK蛋白相对表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义。见表1、图2。

图1 p-JNK和p-P38MAPK在正常皮肤组织和寻常性银屑病皮损组织的表达（免疫组化×400） p-JNK在正常对照皮肤个别表皮细胞核中有少量表达，呈淡褐色，在寻常性银屑病皮损表皮全层细胞的细胞核和细胞质中呈深棕色表达；p-P38MAPK在正常对照皮肤表皮细胞核中有少量表达，呈浅棕色，在寻常性银屑病皮损表皮全层细胞的细胞核中有表达，呈深棕色

表1 寻常性银屑病患者皮损和正常对照组皮肤p-JNK和p-P38MAPK的表达水平比较（±s）

表1 寻常性银屑病患者皮损和正常对照组皮肤p-JNK和p-P38MAPK的表达水平比较（±s）

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图2 Western印迹法检测寻常性银屑病皮损与正常对照皮肤中p-JNK和p-P38MAPK蛋白的相对表达量 1：正常对照皮肤；2：寻常性银屑病皮损；寻常性银屑病皮损中p-JNK和p-P38MAPK蛋白的表达均明显高于正常对照皮肤

讨 论

正常细胞依靠细胞内各种信号传导分子的活化来完成其增殖、分化、凋亡的生命历程。若机体内细胞信号转导功能异常改变，会导致细胞增殖和分化异常等。银屑病作为一种慢性炎症性皮肤病，与表皮细胞过度增殖及异常分化、真皮乳头血管增生等有关。MAPK主要参与了细胞的增殖与分化，有关寻常性银屑病与信号通路的研究成为近年生物医学研究领域的热点。

MAPK是能够接受各种有丝分裂原刺激而活化的一种蛋白激酶，在细胞增殖调控中发挥极其重要的作用。MAPK的激活在肿瘤的发生中起着重要的作用，我们的前期研究［2］发现，磷酸化的MAPK家族的 3个主要成员（ERK1/2、JNK和P38MAPK）与其上游因子EGFR及下游转录因子Elk-1在日光性角化病（AK）和皮肤鳞状细胞癌（SCC）中的表达较正常皮肤明显增强，且 p-EGFR、p-ERK1/2、p-JNK、p-P38MAPK及p-Elk-1蛋白在皮肤SCC中的表达与其病理分级有关，推测磷酸化的 EGFR→ERK1/2、JNK、P38MAPK→Elk-1信号转导途径可能在AK和SCC的发生发展中起重要的促进作用。

MAPK的激活在寻常性银屑病发病中的作用尚不清楚。张晓艳等［3］研究发现，与正常人表皮中MAPK的激酶活性相比，银屑病患者皮损区MAPK的活性明显增高，而非皮损区无明显改变，认为MAPK可能参与了银屑病表皮细胞过度增殖的调节。我们的前期研究［1］还发现，磷酸化的 ERK1/2、EGFR 和Elk-1在寻常性银屑病皮损中的表达较正常皮肤的表达明显增强，推测p-EGFR→ERK1/2→Elk-1这条信号通路的传导增强可能在寻常性银屑病的病理生理过程中起重要的作用。但JNK与P38MAPK与寻常性银屑病的关系尚存争议。Chen等［4］发现JNK-c-Jun的激活可以促进寻常性银屑病FOXP3的核转录。Arasa等［5］发现，抑制SAPK/JNK通路可影响寻常性银屑病细胞因子的释放和STAT3通路的激活。Takahashi等［6］研究表明，磷酸化的JNK在寻常性银屑病受累皮肤较非受累皮肤表达升高，但磷酸化P38MAPK在寻常性银屑病皮损与正常人皮肤中的表达无差异，且磷酸化JNK在银屑病患者未受累皮肤和正常人皮肤只表达于颗粒层，在银屑病皮损的颗粒层和棘层均有表达。本研究显示，磷酸化的JNK在正常对照皮肤的个别细胞核中有较弱的表达，在寻常性银屑病皮损表皮全层细胞的细胞核和细胞质中呈深棕色表达，其表达程度明显高于正常对照组，而磷酸化的P38MAPK在寻常性银屑病皮损和正常对照组皮肤中均表达于细胞核中，但在银屑病皮损中的表达明显增强。在MAPK家族中JNK与P38定位于细胞质与（或）细胞核，以非活化形式存在。一旦被激活，细胞质中的JNK与P38移位到细胞核。JNK与P38MAPK可以诱导Th1/Th2分化，与银屑病表皮高度增殖有关，前者主要诱导Th2分化，后者主要诱导Th1分化［7］。同时JNK激活后也可通过程序性细胞死亡而终止病毒复制，表明JNK可能是宿主细胞通过细胞凋亡的作用抵抗病毒入侵的一个防御机制，这可阻断由感染诱发的银屑病。

［1］葛新红,秦璟,张晓鸣,等.细胞外信号调节激酶在寻常性银屑病皮损中的表达［J］.中华皮肤科杂志,2010,43（12）:855-858.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2010.12.011.Ge XH,Qin J,Zhang XM,et al.Expression of extracellular signalregulated kinase in lesions of psoriasis vulgaris［J］.Chin J Dermatol,2010,43（12）:855-858.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2010.12.011.

［2］葛新红,唐真真,焦亚宁,等.光线性角化病和鳞状细胞癌表皮生长因子受体与MAPK信号通路的研究［J］.中华皮肤科杂志,2015,48（7）:451-454.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.003.Ge XH,Tang ZZ,Jiao YN,et al.Epidermal growth factor receptor and MAPK signaling pathways in actinic keratosis and cutaneous squamous cell carcinoma［J］.Chin J Dermatol,2015,48（7）:451-454.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.003.

［3］张晓艳,张立新,马圣清,等.银屑病患者皮损中有丝分裂原激活的蛋白激酶的活性研究［J］.皮肤病与性病,2005,27（1）:4-6.DOI:10.3969/j.issn.1002-1310.2005.01.002.Zhang XY,Zhang LX,Ma SQ,et al.Up-regulation of mitogenactivated protein kinase activity in psoriatic lesions［J］.J Dermatol Venereol,2005,27（1）:4-6.DOI:10.3969/j.issn.1002-1310.2005.01.002.

［4］Chen L,Wu J,Ren W,et al.c-Jun N-terminal kinase（JNK）-phospho-c-JUN （ser63/73）pathway is essential for FOXP3 nuclear translocation in psoriasis［J］.J Dermatol Sci,2013,69（2）:114-121.DOI:10.1016/j.jdermsci.2012.10.018.

［5］Arasa J,Terencio MC,Andrés RM,et al.Decreased SAPK/JNK signalling affects cytokine release and STAT3 activation in psoriatic fibroblasts［J］.Exp Dermatol,2015,24 （10）:800-802.DOI:10.1111/exd.12787.

［6］Takahashi H,Ibe M,Nakamura S,et al.Extracellular regulated kinase and c-Jun N-terminal kinase are activated in psoriatic involved epidermis［J］.J Dermatol Sci,2002,30（2）:94-99.DOI:10.1016/S0923-1811（02）00064-6.

［7］Rengarajan J,Szabo SJ,Glimcher LH.Transcriptional regulation of Th1/Th2 polarization［J］.Immunol Today,2000,21（10）:479-483.DOI:10.1016/S0167-5699（00）01712-6.

Expressions of phosphorylated c-Jun N-terminal kinase and P38 mitogen-activated protein kinase in psoriasis vulgaris lesions

Ge Xinhong,Tang Zhenzhen,Jiao Yaning,Wu Hao,Yu Nan,Dong Lingdi,Li Le,Yang Biao,Pu Xiaoxia Department of Dermatology,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China（Ge XH,Jiao YN,Yu N,Dong LD,Li L）;Department of Dermatology,Lanling People′s Hospital,Linyi 277700,Shandong,China（Tang ZZ）;Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China（Wu H,Yang B,Pu XX）

ObjectiveTo investigate expressions of phosphorylated c-Jun N-terminal kinase（p-JNK）and P38 mitogen-activated protein kinase（p-P38MAPK）in psoriasis vulgaris lesions.MethodsTissue specimens were obtained from lesions of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 30 healthy human controls.An immunohistochemical study and Western-blot analysis were performed to measure protein expressions of p-JNK and p-P38MAPK in these skin specimens.ResultsAs the immunohistochemical study showed,the expressions of p-JNK and p-P38MAPK（expressed as the average optical density ［AOD］value for targeted proteins）were significantly higher in psoriasis vulgaris lesions than in normal skin tissues（p-JNK:0.663±0.016 vs.0.333±0.009,t=44.869,P＜0.001;p-P38MAPK:0.436±0.011 vs.0.306±0.010,t=21.913,P＜0.001）.Western-blot analysis also showed increased protein expressions of p-JNK and p-P38MAPK in psoriasis vulgaris lesions compared with normal skin tissues（t=20.477,165.084,respectively,bothP＜0.05）.ConclusionThe activation of JNK and P38MAPK may be involved in the overproliferation of epidermal cells in psoriasis vulgaris lesions.

Psoriasis;JNK mitogen-activated protein kinases;p38 mitogen-activated protein kinases;C-Jun N-terminal kinase

Ge Xinhong,Email:gexinhong.0101@163.com

葛新红，Email：gexinhong.0101@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.005

国家自然科学基金（81060181）；宁夏自然科学基金（NZ14121）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81060181）;Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region of China（NZ14121）

2015-08-13）

（本文编辑：周良佳 颜艳）