内质网氨基肽酶1基因rs27044、rs30187和rs26653多态性与汉族寻常性银屑病相关性研究

韩建文 王勇 李东霞 白云花 阿拉腾楚鲁 吕新翔 乌日娜

010050呼和浩特，内蒙古医科大学附属医院皮肤科（韩建文、李东霞、阿拉腾楚鲁、吕新翔、乌日娜），风湿科（王勇）；呼伦贝尔市人民医院皮肤科（白云花）

内质网氨基肽酶1基因rs27044、rs30187和rs26653多态性与汉族寻常性银屑病相关性研究

韩建文 王勇 李东霞 白云花 阿拉腾楚鲁 吕新翔 乌日娜

010050呼和浩特，内蒙古医科大学附属医院皮肤科（韩建文、李东霞、阿拉腾楚鲁、吕新翔、乌日娜），风湿科（王勇）；呼伦贝尔市人民医院皮肤科（白云花）

目的 探讨内质网氨基肽酶1（ERAP1）基因多态性与汉族人寻常性银屑病的遗传关联性。方法收集寻常性银屑病患者289例，对照组292例，知情同意后采集外周静脉血5 ml。选择位于ERAP1基因编码区域的3个单核苷酸多态性（SNP），利用连接酶检测反应进行基因分型（rs27044、rs30187和rs26653）。利用PLINK1.07软件进行统计分析，χ2检验比较患者组与对照组等位基因频率及基因型频率，计算等位基因的相对危险度估计值比值比（OR）及其95%可信区间（95%CI）。利用Haploview软件进行单倍型分析。结果 rs30187等位基因C及rs26653等位基因G在患者组的频率（分别为0.460 2和0.430 8）、尤其是早发型组中的频率（0.448 5和0.422 7）均明显低于对照组（0.534 2和0.501 7），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。rs27044、rs30187及rs26653这3个SNP两两间均存在强连锁不平衡（r2≥0.717，D′≥0.962）。基因型分析结果显示，在隐性遗传模式下，rs30187在患者组及早发型组的基因型频率均显著低于对照组，差异均有统计学意义（P值分别＜0.05和＜0.016 7）。单倍型分析发现，单倍型（H4：CTC）在患者组的频率（0.050）、尤其是早发型组的频率（0.052）均明显高于对照组（0.022），差异均有统计学意义（P值分别＜0.05、＜0.016 7）。结论 ERAP1基因多态性与汉族人寻常性银屑病可能相关，特别是早发型患者。危险单倍型（H4：CTC）可能是寻常性银屑病一个重要的易感因素。

银屑病；多态性，单核苷酸；全基因组关联研究；单倍型；基因频率；基因型；基因，ERAP1

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，根据发病年龄可分为早发型（发病年龄＜40岁）和晚发型（发病年龄≥40岁）［1］。遗传学研究已发现许多银屑病易感基因，特别是最近的外显子测序研究发现了与疾病风险相关基因的编码区变异，例如白细胞介素 23受体（IL23R）、缝隙连接蛋白 β2（GJB2）、表皮终末分化角质外膜蛋白3D（LCE3D）、锌指蛋白816（ZNF816A）、凋亡加强结构域蛋白 14（CARD14）和内质网氨基肽酶 1（ERAP1）［2-3］，其中 ERAP1 基因与人类白细胞抗原（HLA）-Cw*06:02存在交互作用，可增加银屑病的易感性［4］。由于HLA-Cw*06:02是银屑病最强的一个遗传易感因素，有人推测ERAP1可能通过与HLA-C相互作用从而影响银屑病的易感性［5-6］。根据既往研究［2-3］，本研究选择ERAP1基因编码区域的3个单核苷酸多态性（SNP），利用连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）进行基因分型，探讨其与汉族人寻常性银屑病（PsV）的相关性。

资料与方法

一、资料

1.研究对象：从内蒙古医科大学附属医院收集汉族PsV患者289例，无银屑病的汉族对照组292例。抽取外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，置于-80℃冰箱保存备用。所有患者经临床及病理证实诊断，符合PsV诊断标准。所有对照排除银屑病及其他自身免疫疾病，排除银屑病家族史。本研究已通过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言，研究对象均签署知情同意书。

2.SNP选择：根据既往文献报道，在ERAP1基因区域选择3个位于编码区的银屑病相关SNP，包括rs27044（c.2535 C ＞ G，［p.730［Gln］＞［Glu］）、rs30187（c.1930 A ＞ G，p.［Lys］＞［Arg］）和 rs26653（c.727G ＞ C，p.［Arg］＞［Pro］）［2-3］。

二、方法

1.基因组DNA提取：利用基因组DNA提取试剂盒（中国康宁生命科学有限公司）提取患者及对照组基因DNA，用分光光度仪分别于260 nm和280 nm波长处检测吸光度，计算DNA浓度，并用凝胶电泳检测DNA质量，所有DNA样本均合格。

2.引物及探针的合成：利用Primer 3 online（Version 0.4.0）软件（http://frodo.wi.mit.edu/）和 Oligo（Version 6.31）软件设计特异性引物和LDR探针，针对每个SNP位点设计2条引物，尽量保证所有SNP位点引物的T值相同，由上海瀚宇生物工程有限公司合成，其序列见表1。根据LDR探针设计原则设计LDR的上下游探针［7］，上游探针5′端用磷酸化修饰，LDR探针由上海英骏生物技术有限公司合成，其序列见表2。

3.多重 PCR：反应体系 20 μl，1 μl模板，2 μl Buffer缓冲液，0.6 μl Mg2+，2 μl dNTP，0.2 μl TaqDNA聚合酶，2 μl引物混合液，加双蒸水补足。PCR反应条件：95℃预变性 2 min；94℃30 s，56℃退火1.5min，65℃30s，35个循环；最后65℃延伸 10min。

4.多重 LDR：反应体系 10 μl，1 μl Buffer缓冲液，1 μl探针混合液，0.05 μl Taq DNA 连接酶，4 μl PCR产物，加双蒸水补足10 μl。探针混合液浓度为2 μmol/L。LDR 反应条件：95℃ 2 min预变性，94℃15 s，50 ℃ 25 s，进行 40 个循环。

5.测序与基因分型：采用ABI3730测序仪测序分析反应产物，用Genemapper软件进行数据分析，判读各位点上各样本的基因分型。测序工作由上海翼和应用生物技术有限公司完成。

表1 PCR引物序列

三、统计分析

所有SNP分型数据质控、等位基因及基因型频率比较采用 PLINK 1.07软件（http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）［8］。计算 3 个 SNP 的等位基因频率，在病例和对照中分别进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。采用χ2检验比较患者组及对照组等位基因频率及基因型频率，并计算等位基因的相对危险度估计值比值比（OR）及其95%可信区间（CI）。对3个SNP间进行连锁不平衡检验，计算两两间的r2和D′值，如果r2＞0.5和D′＞0.8，认为SNP间存在强连锁不平衡。对早发型和晚发型患者进行分层分析［1］。单倍型分析采用Haploview软件完成。所有统计检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义，多重比较时按Bonferroni多重检验校正原理，调整检验水准为0.016 7（0.05/3）。研究效力使用在线版的遗传研究效力计算器计算［9］。

结 果

一、样本及SNP质控

患者组289例，年龄（46.80±16.55）岁，发病年龄（30.07±15.00）岁，男女比例为 1.65∶1。对照组292例，年龄（35.90±14.65）岁，男女比例为 1.12∶1。两组性别比例差异无统计学意义（χ2=0.92，P＞0.05）。患者组年龄高于对照组（t=9.09，P＜0.05）。3个SNP分型得率为100%，在病例及对照中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P＞0.05）。

二、等位基因频率比较及连锁不平衡检验

见表3。rs30187等位基因C及rs26653等位基因G在患者组的频率均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。早发型组中这2个SNP等位基因频率均明显低于对照组（P＜0.016 7），而晚发型组与对照组的差异均无统计学意义。rs27044等位基因G频率在PsV早发型组、晚发型组与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.016 7）。

对rs27044、rs30187及rs26653进行两两间连锁不平衡检验，均存在强连锁不平衡（rs27044与rs30187：r2=0.851，D′=0.985；rs27044 与 rs26653：r2=0.717，D′=0.962；rs30187 与 rs26653：r2=0.843，D′=0.997）。采用logistic回归分析，当控制rs30187后，rs26653与PsV无相关性（P=0.819）；控制rs26653后，rs30187也没有相关性（P=0.432 4），提示二者相互依附，非独立相关。

表2 LDR探针序列

表3 汉族寻常性银屑病患者与对照组ERAP1基因上3个编码SNP等位基因频率的比较

三、基因型分析

在不同遗传模式下比较患者组（早发型和晚发型）和对照组的基因型分布，发现在隐性遗传模式下，rs30187在患者组基因型频率低于对照组（P＜0.05），其中早发型组显著低于对照组（P＜0.016 7）。在显性遗传模式下，rs26653在患者组基因型频率低于对照组（P＜0.05），但早发型或晚发型组与对照组间的差异无统计学意义。rs27044基因型频率在显性和隐形遗传模式下，患者组（包括早发型、晚发型、及全部患者）与对照组间差异均无统计学意义（P＞0.016 7）。见表4、5。

表4 显性与隐性遗传模式下汉族寻常性银屑病患者与对照组ERAP1基因上编码SNP的rs30187_C基因型分析

表5 显性与隐性遗传模式下汉族寻常性银屑病患者与对照组ERAP1基因上编码SNP的rs26653_G基因型分析

表6 汉族寻常性银屑病患者与对照组ERAP1基因上3个编码SNP的单倍型分析

四、单倍型分析

利用3个编码SNP构建单倍型，分析每个单倍型在患者组和对照组中的分布，发现单倍型H4（CTC）在患者组中的频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），其中早发型组显著高于对照组（P＜0.016 7）。另1个单倍型H2（CCG）在患者组中的频率低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），但早发型或晚发型组与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.016 7）。见表6。

讨 论

ERAP1基因位于染色体5q15，编码的蛋白是一种具有多种功能的酶，参与免疫应答和炎症反应的调节。特别是它可以参与主要组织相容性抗原（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类抗原的提呈过程，在抗原肽的加工处理、提呈中发挥重要作用［10-11］。既往研究发现，银屑病的易感性与HLA-C明显相关，特别是早发型患者［12］。

本研究结果显示，ERAP1基因编码区SNP（rs30187和rs26653）与早发型PsV相关，而与晚发型PsV无关。连锁不平衡分析及控制分析结果提示，本研究分型的3个SNP相互间存在强连锁不平衡，可能代表同一关联信号。既往研究报道，早发型PsV与MHC存在明显的相关性［4］，并且ERAP1基因对银屑病的易感性与HLA-C相关［5-6，13-14］，提示ERAP1基因可能通过MHC发挥作用，影响银屑病的易感性。此外，ERAP1基因多态性（rs30187和rs26653）与另一种MHC相关的免疫性疾病——强直性脊柱炎的遗传易感性也具有相关性，且ERAP1基因多态性与MHC基因多态性的交互作用也会增加强直性脊柱炎的易感风险，尤其是rs30187［4］。ERAP1基因变异如何影响银屑病易感性目前仍不能明确。ERAP1在HLAⅠ类抗原结合和提呈抗原肽的过程中起到调节作用，其次体外实验证实，ERAP1可以将细胞膜表面的细胞因子受体清除，包括肿瘤坏死因子受体1、白细胞介素1受体2（IL-1R2）、IL-6Rα［15-17］。可能由于这些编码区 SNP 的变化导致基因功能或结构改变，继而影响MHC抗原提呈，增加银屑病的易感性。但这一过程如何发生仍有待进一步的功能学实验探索。

本研究结果提示，rs30187的等位基因C可能呈隐性遗传模式，其基因型CC在患者组分布比例是对照组的0.62倍，在早发型组分布比例是对照组的0.55，提示rs30187的基因型CC是PsV的一个保护性因素，特别是早发型PsV。单倍型分析结果提示，危险单倍型H4（CTC）频率在银屑病组显著高于对照组（OR=2.32），尤其在早发型组中的频率显著高于对照组（OR=2.39），提示该单倍型可能是银屑病发生的一个危险因素，特别是早发型PsV。

综上所述，本研究通过遗传学方法证实ERAP1基因多态性与汉族人PsV相关，特别是与早发型PsV相关。危险单倍型H4（CTC）可能是银屑病一个重要易感因素，进一步提示ERAP1基因在银屑病发病机制中发挥着重要作用。

本研究仍存在一些不足之处：第一，由于研究的样本量不够大，尤其是晚发型样本更少，不能除外ERAP1基因多态性与晚发型银屑病相关性。基于样本量、银屑病发病率计算研究效力，对于rs27044的OR值为1.17，等位基因频率为0.45，在检验水准α=0.05的条件下，研究效力仅为18%。因此，虽未发现rs27044在患者组和对照组间的差异，也不能除外rs27044与汉族人PsV的相关性。第二，本研究仅对ERAP1基因3个SNP进行了验证实验，该区域可能还存在其他银屑病易感变异。第三，对照组平均年龄小于病例组，也可能导致假阴性或假阳性结果。这些变异如何影响ERAP1基因功能，在银屑病发病机制中发挥的具体作用仍未明确，尚需进一步的功能学研究。

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Association of rs27044,rs30187 and rs26653 single nucleotide polymorphisms in the endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 gene with psoriasis vulgaris in a Chinese Han population

Han Jianwen,Wang Yong,Li Dongxia,Bai Yunhua,Alateng Chulu,Lyu Xinxiang,Wu Rina
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China（Han JW,Li DX,Alateng CL,Lyu XX,Wu RN）;Department of Rheumatism,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China（Wang Y）;Department of Dermatology,Hulunbeier People′s Hospital,Hulunbeier 021000,Inner Mongolia,China

ObjectiveTo investigate the association between endoplasmic reticulum aminopeptidase 1（ERAP1）gene polymorphisms and psoriasis vulgaris（PsV）in a Chinese Han population.MethodsFive milliliters of venous blood samples were collected from 289 patients with PsV and 292 human controls of Han nationality after informed consent.Three single nucleotide polymorphisms （SNPs）in the encoding area of the ERAP1 gene,including rs27044,rs30187 and rs26653,were genotyped by ligase detection reaction （LDR）.With the PLINK 1.07 package,statistical analysis was carried out by using the chi-square test for comparisons of allele and genotype frequencies between the patient group and control group.The allelic odds ratio （OR）and its 95%confidence interval（CI）were calculated.In addition,haplotype analysis was conducted with the Haploview software.ResultsThe frequencies of rs30187_C and rs26653_G alleles were significantly lower in the patient group （0.460 2 and 0.430 8 respectively）,especially in patients with early-onset PsV（0.448 5 and 0.422 7 respectively）,than in the control group（0.534 2 and 0.501 7 respectively,allP＜0.05）.The SNPs rs27044,rs30187 and rs26653 showed strong linkage disequilibrium with each other（r2≥0.717,D′≥0.962）.Genotype analysis showed that the frequency of the rs30187 CC genotype was significantly lower in the patient group,especially in patients with early-onset PsV,than in the control group （P＜0.05 and 0.016 7 respectively）under a recessive mode of inheritance.Haplotype analysis revealed that the frequency of the haplotype H4:CTC was significantly increased in the patient group（0.050）,especially in patients with early-onset PsV（0.052）,compared with the control group（0.022,P＜0.05 and 0.016 7 respectively）.ConclusionsERAP1 gene polymorphisms are associated with PsV,especially with early-onsetPsV in Chinese Han population.The risk haplotype H4:CTC may be a susceptible factor for PsV.

Psoriasis;Polymorphism,single nucleotide;Genome-wide association study;Haplotypes;Gene frequency;Genotype;Genes,ERAP1

Han Jianwen,Email:hanjianwen1981@hotmail.com

韩建文，Email：hanjianwen1981@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.003

国家自然科学基金（31160192）；内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科研计划项目（201303057）；内蒙古自治区高等学校“青年科技英才支持计划”（NJYT-14-B17）；中国科学院“西部之光”人才培养计划（2014-YB87）；内蒙古医科大学青年创新基金（NY2011QN005）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31160192）;Medical and Health Research Project of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission （201303057）;Program for Young Talents of Science and Technology in Universities of Inner Mongolia Autonomous Region （NJYT-14-B17）;CAS"Light of West China"Program（2014-YB87）;Youth Innovation Fund of Inner Mongolia Medical University（NY2011QN005）

2015-04-15）

（本文编辑：颜艳）