HPLC梯度洗脱法测定对乙酰氨基酚口服混悬液中有关物质

余俊玲　钟　瑜　徐伟斌

（广州博济医药生物技术股份有限公司广州510700）

HPLC梯度洗脱法测定对乙酰氨基酚口服混悬液中有关物质

余俊玲钟瑜徐伟斌

（广州博济医药生物技术股份有限公司广州510700）

目的：采用高效液相色谱法（HPLC）梯度洗脱测定对乙酰氨基酚口服混悬液中有关物质含量。方法：用Inertsustain C18（250mm×4.6mm，5μm）为色谱柱；以0.05mol·L-1醋酸铵溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱；检测波长为245nm，流速为1.0mL·min-1，柱温为25℃。结果：各峰间能完全分离；对乙酰氨基酚和对氨基酚的最低检测浓度分别为0.027μg·mL-1和0.093μg·mL-1；对乙酰氨基酚在0.037～0.33μg·mL-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，对氨基酚在0.26～3.09μg·mL-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系；中间精密度试验对氨基酚RSD为13.77％。结论：该方法专属性好、灵敏、结果准确，可用于对乙酰氨基酚口服混悬液的有关物质含量控制。

高效液相色谱法 梯度洗脱 对乙酰氨基酚口服混悬液 对氨基酚 有关物质

对乙酰氨基酚是目前主要用于解热镇痛的药物，抗炎作用极弱，对胃肠道无明显刺激，为止痛首选药物之一。药品的质量、安全均与有关物质有关。对氨基酚是对乙酰氨基酚生产时带入或对乙酰氨基酚及其制剂储存时产生的降解产物，对人体有一定的毒性[1]，因此要严格控制对氨基酚及其他有关物质。2015版《中国药典》[2]收载有对乙酰氨基酚原料及制剂的质量标准，有关物质的检测采用了HPLC法。有文献报道[3]测定对乙酰氨基酚口服溶液中的有关物质，采用HPLC等度洗脱法，但戴正琳[3]最后在文中提出采用HPLC梯度洗脱法更优。也有文献报道[4]采用HPLC梯度洗脱法测定对乙酰氨基酚原料中有关物质，未见采用HPLC梯度洗脱法测定口服混悬液中的有关物质报道。本文采用HPLC梯度洗脱法测定对乙酰氨基酚口服混悬液中的有关物质，方法专属、灵敏、结果准确，可用于对乙酰氨基酚口服混悬液的质量控制。

1　仪器与试药

e2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司，DAD，二极管阵列检测器），LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），CPA 225D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；对乙酰氨基酚对照品来自中国食品药品检定研究院，批号100018-201409，对氨基酚对照品来自中国食品药品检定研究院，批号00802-201203；对乙酰氨基酚口服混悬液（泰诺林，上海强生制药有限公司，批号：150426216）；甲醇为色谱纯，醋酸、醋酸铵为分析纯，水：屈臣氏蒸馏水。

2　方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：岛津Inertsustain C18键合硅胶柱（250mm×4.6mm，5μm）；以0.05mol·L-1醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B按表1进行梯度洗脱，检测波长为245nm，流速为1.0mL·min-1，柱温为25℃，进样量为10μL；稀释剂为0.05mol·L-1醋酸铵溶液-甲醇（85∶15）。

表1　梯度洗脱表

2.2系统适用性：精密称取本品、对氨基酚对照品适量加稀释剂溶解并稀释制成每1mL约含2mg对乙酰氨基酚和每1mL约含4μg对氨基酚的混合溶液；再精密称取阴性样品、原料适量分别加稀释剂溶解并稀释制成每1mL相当含6mg对乙酰氨基酚的阴性溶液和每1mL约含2mg对乙酰氨基酚的原料供试液，取各供试液滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图，以系统适用性色谱图计，理论塔板数按对乙酰氨基酚峰计为9522，对乙酰氨基酚与对氨基酚分离度为18，与其他各峰分离度均大于1.5（见图1）。

2.3专属性

2.3.1未破坏试验：精密称取本品适量，用稀释剂配制成每1mL约含2.5 mg的对乙酰氨基酚溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图（见图2A）。

2.3.2氧化破坏试验：精密称取本品适量，加入30％H2O2溶液1mL，常温放置1h，用稀释剂配制成每1mL约含2.5mg的对乙酰氨基酚溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图（见图2B）。

2.3.3酸破坏试验：精密称取本品适量，加入1mL 1mol·L-1的盐酸溶液，置60℃水浴2.5h，待冷却至室温，用1mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至中性，用稀释剂配制成每1mL约含2.5mg的对乙酰氨基酚溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图（见图2C）。

2.3.4碱破坏试验：精密称取本品适量，加入1mL 1mol·L-1的氢氧化钠溶液，置60℃水浴2.5h，待冷却至室温，用1mol·L-1盐酸溶液调pH至中性，用稀释剂配制成每1mL约含2.5mg的对乙酰氨基酚溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图（见图2D）。

2.3.5高温破坏试验：精密称取本品适量，置60℃水浴6h，待冷却至室温，用稀释剂配制成每1mL约含2.5 mg的对乙酰氨基酚溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图（见图2E）。

2.3.6强光破坏试验：精密称取本品适量，置紫外灯下照射6h，用稀释剂配制成每1mL约含2.5mg的对乙酰氨基酚溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图（见图2F）。

综上所述，各条件下，主峰与其他峰、其他峰之间均能达到基线分离，说明方法专属性强，可用于本品的杂质检测。

2.4检测限和定量限：精密称取对乙酰氨基酚、对氨基酚对照品适量，用稀释剂溶解并稀释制成每1mL约含2.5mg的对乙酰氨基酚溶液和每1mL约含2.6μg的对氨基酚溶液，再分别稀释数倍制成系列溶液，按“2.1”项下色谱条件检测，当信噪比（S/N）约为3时，检测限分别为0.027μg·mL-1和0.093μg·mL-1；当信噪比（S/N）约为10时，定量限分别为0.041μg·mL-1和0.22μg·mL-1。

2.5精密度试验

2.5.1进样精密度：取“2.2”项下系统适用性溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以峰面积计算对氨基酚RSD为1.29％，其他杂质峰RSD分别为1.62％、0.97％、0.58％。结果表明进样精密度良好。

2.5.2中间精密度：精密称取本品、对氨基酚对照品适量加稀释剂溶解并稀释制成每1mL约含2.5mg的对乙酰氨基酚和每1mL约含2.6μg对氨基酚混合溶液6份，滤过，作为供试品溶液；精密量取1mL置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为对照溶液；另精密称取对氨基酚对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL约含2.6μg的溶液，作为对照品溶液。分别由不同人员在不同仪器按“2.1”项下色谱条件检测，计算对氨基酚含量及其他各杂质量。对氨基酚平均含量为0.034％，RSD为13.77％，未知杂质1平均为0.008％，RSD为20.31％，未知杂质2平均为0.041％，RSD为15.79％，未知杂质3平均为0.037％，RSD为16.23％。结果表明，中间精密度均符合要求。

2.6线性范围：精密称取对乙酰氨基酚、对氨基酚对照品适量，用稀释剂溶解并稀释制成0.037～0.33μg·mL-1和0.26～3.09μg· mL-1的系列浓度溶液，按“2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图，分别以峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，结果回归方程分别为：A=37728C-0.220，r=0.998；A=14215C+351.9，r=0.998。

2.7回收率：精密称取对氨基酚对照品适量用稀释剂溶解并配制成每1mL约含20.0μg的对氨基酚溶液，精密移取3mL置25mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密称取本品适量（约相当于对乙酰氨基酚125mg），分别置11个50mL量瓶中，分别加适量稀释剂溶解，取9个分组，每3个为1组，每组分别加入对氨基酚溶液4mL、6mL、8mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，另2个分别用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为阴性供试品溶液；取对照品溶液和各供试品溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件检测，计算回收率，试验结果见表2，平均回收率为98.3％，RSD为2.91％，该方法准确度良好。

表2　回收率试验结果

2.8溶液稳定性

2.8.1对氨基酚溶液稳定性：精密称取对氨基酚对照品适量，用稀释剂溶解并稀释制成2.6μg·mL-1的溶液，分别在0、2、4、6h按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积计算RSD为1.77％。结果表明该溶液在6h内基本稳定。

2.8.2加对氨基酚的样品溶液稳定性：取“2.5.2”项下供试品溶液1份，分别在0、2、4、6、8h按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积计算对氨基酚RSD为1.63％，其他杂质峰RSD分别为1.58％、0.89％、0.76％。结果表明该溶液在8h内基本稳定。2.9耐用性试验：微小调整“2.1”项下的流动相比例、流速、柱温及色谱柱后，取“2.2”项下系统适用性溶液进行试验，记录色谱图，用分离度进行评价。结果表明，选定的色谱条件进行微小调整后，各峰之间分离度均符合要求，耐用性良好。

3　方法的比较

取本品适量，加稀释剂溶解稀释制成溶液，滤过，按“2.1”项下色谱条件测定，并与现行方法[5]进行比较，拟定方法较现行方法检测灵敏度更高，杂质检出数更多，具体结果见表3。

表3　方法比较结果

4　讨论

4.1取本品在氧化、酸、碱、高温、强光条件破坏后，在拟定色谱条件下检测，各峰间均能达到基线分离，各峰纯度均符合要求，各条件下物料平衡。

4.2溶液稳定性的考察结果表明，供试品溶液及对氨基酚溶液均应临用新制。

4.3因《中国药典》[2]规定对氨基酚不得过对乙酰氨基酚标示量的0.1％，其他各杂质和不得大于1.0％，制定一个方便的测定杂质方法很重要，本文拟定方法测定杂质操作简单，专属性强，结果准确可靠。

[1]庄幼龄，邱麒.HPLC法测定对乙酰氨基酚缓释干混悬剂的有关物质[J].海峡药学，2010，22（2）：45-48.

[2]中国药典.2015.Vol（二部）：318-323.

[3]戴正琳，陶志.HPLC法测定对乙酰氨基酚口服溶液中的有关物质对氨基酚[J].药物分析杂质，2011，31（4）：785-787.

[4]赵金会，王金彬.HPLC梯度洗脱法测定对乙酰氨基酚原料药及有关物质对氨基酚[J].北方药学，2012，9（10）：1-2.

[5]新药转正标准[S].第77册，149.

Determinarion of related substances in paracetamol oral suspension using HPLC with gradient elution

Yu Junling Zhong yu Xu Weibin（GuangZhou boji Medical Biotechnological Co．Ltd，Guangzhou 510700，China）

Objective：To established an HPLC method for the determination of related substances in paracetamol oral suspension．Methods：A Inertsustain C18column（250mm×4．6mm，5μm）was adopted．The mobile phase of gradient elution was ammonium acetate solution of 0.05mol·L-1and methanol．The wavelength of detector was 245nm，the flow rate was 1.0mL·min-1，the Column temperature was 25℃．Results：Any two peaks was completely separated．The detected limit were 0.027μg·mL-1and 0.093μg·mL-1for paracetamol and 4-aminophenol．The calibration curve was l inear in the range of 0.037～0.33μg·mL-1and 0.26～3.09μg·mL-1．the RSD was 13.77％（n=12）for 4-aminophenol．Conclusion：The proposed HPLC method could be used for the determination of reltated substances in paracetamol oral suspension．

HPLC Gradient elution Paracetamol oral suspension 4-aminophenol Related matt

R927.2

A

1672-8351（2016）10-0005-03