阿加曲班细菌内毒素检查法研究

罗　婷李书渊

（1.广东药科大学药科学院广州510006；2.广州市药品检验所广州510160；3.广东药科大学中药学院广州510006）

阿加曲班细菌内毒素检查法研究

罗婷1,2李书渊3*

（1.广东药科大学药科学院广州510006；2.广州市药品检验所广州510160；3.广东药科大学中药学院广州510006）

目的：对阿加曲班进行细菌内毒素检查法的研究，建立阿加曲班细菌内毒素检查法。方法：按《中国药典》2010年版附录XI E进行实验，确立阿加曲班细菌内毒素检查法。结果：阿加曲班细菌内毒素不得过1.85EU/mg。结论：建立的阿加曲班细菌内毒素检查方法可行。

阿加曲班 细菌内毒素 干扰试验

阿加曲班是一种凝血酶抑制剂，可逆地与凝血酶活性位点结合。阿加曲班注射液作为静脉注射液用于对慢性动脉闭塞症（血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症）患者的四肢溃疡、静息痛及冷感等的改善[1]。阿加曲班原料药细菌内毒素检查方法现行版各国药典均未收载，阿加曲班作为阿加曲班注射液的原料，进行细菌内毒素检查十分必要[2]。

1　仪器和试药

1.1仪器：ET-96内毒素凝胶法测定仪，天平，其他玻璃实验仪器包括移液管、25mL三角烧瓶、试管，所有使用的玻璃仪器经过250℃2h灭菌处理后使用。

1.2试药

1.2.1样品：阿加曲班（意大利Italy EUTICALS S.P.A.，规格/剂型：原料药，批号：ARGAT0017T；ARGAT0015T；ARGAT0016T）。

1.2.2试剂：见表1

表1　试剂Table1 Reagent

2　方法与结果

2.1限值的确定

公式：L=K/M，根据阿加曲班注射液说明书：成人用量：一次10mg（一次一支），一日2次，每次用输液稀释后，进行2～3h的静脉滴注。由此确定M为10mg/（60kg·2h），注射剂K取5EU/（kg·h），由上述公式可得出L=60EU/mg。

由于阿加曲班原料药细菌内毒素检查方法现行版各国药典均未收载，日本三菱制药厂生产的阿加曲班注射液（2mL：10mg）在进口药品注册标准JX20090312中规定细菌内毒素不得过5EU/mL，根据注射剂安全性检查法应用指导原则规定：细菌内毒素检查限值按规定要求计算，据《中国药典》2010年版二部附录XIX M化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则细菌内毒素或热原检查：“若属于心血管药的限值可严格至计算值的1/3～1/2，以保证用药安全。”L=1.85EU/mg。

2.2鲎试剂灵敏度复核实验：按照《中国药典》2010年二部附录XI E细菌内毒素检查法规定[2]，进行鲎试剂的标示灵敏度复核，结果见表2。

表2　鲎试剂灵敏度复核结果Table2 Results of the tachypleus amebocyte lysate sensibility review

两批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查，λc均在0.5λ～2λ范围内，结果符合规定。

2.3干扰实验预试验

2.3.1阿加曲班有效稀释浓度（MVC）的计算

公式：MVC=λ/L，其中L为细菌内毒素限值1.85EU/mg，λ为鲎试剂标示灵敏度，根据目前市售鲎试剂灵敏度λ通常在0.5～0.03EU/mL。

阿加曲班的对应有效稀释浓度为：C0.5=0.5/1.85=0.27mg/ mL；C0.25=0.25/1.85=0.135mg/mL；C0.125=0.125/1.85=0.068mg/mL；C0.06=0.06/1.85=0.032mg/mL；C0.03=0.03/1.85=0.016mg/mL

2.3.2供试品溶液、细菌内毒素标准溶液的配制：将阿加曲班供试品用细菌内毒素用水溶解，制成初始浓度为50mg/mL混悬液，再用细菌内毒素检查用水分别稀释成浓度为10mg/mL；1.0mg/mL；0.5mg/mL；0.25mg/mL；0.125mg/mL；0.0625mg/mL；0.031mg/mL；0.016mg/mL的一系列溶液（NPC）。

另制备相同浓度的系列供试品溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，作为阳性对照溶液（PPC）[3]。设立细菌内毒素工作标准品阳性对照管（PC）和阴性对照管（NC），然后按细菌内毒素检查法操作，进行预干扰实验。结果见表3、表4。

2.3.3鲎试剂：福州新北生化工业有限公司批号：12110912灵敏度：0.25EU/mL

表3　干扰预试验结果Table3 Pre interference test results

2.3.4鲎试剂：湛江博康海洋生物有限公司批号：1110181灵敏度：0.25EU/mL

表4　干扰预试验结果Table4 Pre interference test results

由此可见，阿加曲班在0.5mg/mL以下的浓度时对鲎试剂的凝集反应无干扰作用。

2.4正式干扰试验：根据预干扰实验结果，取该浓度溶液和细菌内毒素检查用水分别将细菌内毒素标准品制成0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL的一系列溶液。阴性对照：用细菌内毒素检查用水作为阴性对照，记为NC。将上述溶液分别与灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行反应，每一浓度平行做4管。按《中国药典》2010年版二部附录中的“细菌内毒素检查供试品干扰试验项”进行实验。结果见表5、表6。

2.4.1鲎试剂：福州新北生化工业有限公司批号：12110912灵敏度：0.25EU/mL

表5　正式干扰试验结果Table5 Results of the interference test

2.4.2鲎试剂：湛江博康海洋生物有限公司批号：1110181灵敏度：0.25EU/mL

表6　正式干扰试验结果Table6 Results of the interference test

由上表可见，Es/Et均在0.5～2.0之间，表明浓度为0.5mg/ mL的供试品溶液与细菌内毒素之间的凝集反应无干扰，可用于细菌内毒素检查。

2.5样品细菌内毒素检查：阿加曲班有效稀释浓度（MVC）的计算：

MVC=λ/L=0.25/1.85=0.135mg/mL，其中L为细菌内毒素限值1.85EU/mg，λ为鲎试剂标示灵敏度0.25EU/mL。

按《中国药典》细菌内毒素检查法，使用两批不同厂家的鲎试剂分别对样品进行细菌内毒素检查，并同时设立样品的自身阳性对照管，结果见表7、表8。

2.5.1鲎试剂：福州新北生化工业有限公司批号：12110912灵敏度：0.25EU/mL

表7　细菌内毒素检查结果Table7 Results of the bacterial endotoxins test

2.5.2鲎试剂：湛江博康海洋生物有限公司批号：1110181灵敏度：0.25EU/mL

表8　细菌内毒素检查结果Table8 Results of the bacterial endotoxins test

3　讨论

3.1由干扰预试验结果可以得知阿加曲班在0.5mg/mL以上的稀释浓度对鲎试剂的凝集反应存在干扰作用，稀释浓度至0.5mg/mL以下则与鲎试剂的凝集反应无干扰影响。

3.2正式干扰试验使用0.5mg/mL浓度，且用两个厂家鲎试剂结果Es/Et均在0.5～2.0之间无干扰影响。

3.3由于本品供试品溶液为混悬液，试验中发现制成100mg/mL混悬液时样品极难均匀分布在水中，混悬液中还存在不少较大的颗粒，影响下一步的稀释。经试验，使用50mg/mL溶液作为起始浓度，可得到相同结果。建议初始浓度使用50mg/mL或10mg/ mL再作进一步稀释，避免混悬液中颗粒堵塞移液管口。

3.4经测定，样品浓度在0.5mg/mL时的pH值为6.9～7.1，符合《中国药典》规定（规定pH值为6.0～8.0），不影响该样品的凝集试验[4]。

[1]庄源，魏广宽.阿加曲班联合丁苯酞治疗进展性脑梗死疗效分析[J].中国实用医药，2016，3（11）：121-122.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版，北京：中国医药科技出版社，2010：附录85.

[3]刘海疆，陈志勇，田冰，等.长春西汀氯化钠注射液细菌内毒素检查法的研究[J].黑龙江医药，2014，27（1）：108.

[4]张云平，陈启钊.建立血栓通冻干粉针细菌内毒素检查方法[J].医疗装备，2016，2（29）：111-112.

Study on Bacterial Endotoxin test of Argatroban

Luo Ting1，2Li Shuyuan3*（1.School of Pharmacy,Guangdong Parceutical University,Guangzhou Guangdong 510006；2.Guangzhou Institut for Drug Control,Guangzhou Guangdong 510160；3.School of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Parceutical University,Guangzhou Guangdong 510006）

Objective：To establish a method for bacterial endotoxin test of Argatroban．Methods：According to the method for bacterial endotoxin test in Ch.P2010（Appendix XI E），the study was performed．Results：The sample solution of Argatroban at1.85EU/mg or lower concentration could eliminate the interference factors.Conclusion：To establish the method of Bacterial Endotoxin of Argatroban is feasible.

Argatroban Method for bacteria endotoxin test Interference test

R927.2

A

1672-8351（2016）10-0009-03