高效液相色谱法测定灯盏细辛提取物中两种有效成分的含量

李春平　欧春燕

（福建省东山县医院东山363400）

高效液相色谱法测定灯盏细辛提取物中两种有效成分的含量

李春平欧春燕

（福建省东山县医院东山363400）

目的：探讨灯盏细辛提取物中野黄芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸2种有效成分含量的高效液相色谱测定方法。方法：色谱柱选择Dikma Kromasil C18（250mm×4.6mm，5.0μm），流动相选择乙腈：0.2％磷酸溶液=30∶70，检测波长为332nm，柱温为35℃。结果：野黄芩苷的线性回归方程为Y=1.554×103-0.201×102（r=0.9997）；3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸的线性回归方程为Y=1.724×103-0.081×102（r=0.9996）；野黄芩苷在0.0341～1.3121μg范围内，3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸在0.0592～2.3426μg范围内呈良好的线性关系。结论：采用高效液相色谱法同时测定灯盏细辛提取物中2种有效成分的含量，操作简单，精密度高，重现性好，可以作为灯盏细辛提取物中这2种有效成分的定量分析方法。

灯盏细辛提取物 野黄芩苷高效液相色谱法 3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸

灯盏细辛为菊科（Asteraeeae）植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.的干燥全草[1]。灯盏细辛多用于治疗多种眼科疾病，具有确切的临床疗效。有研究表明[2]，一些含有灯盏乙素的中药，如唇形科植物高黄芩、黄芩等未显示与灯盏细辛同等的功效，其中有文献报道[3]对灯盏细辛化学成分进一步系统研究后发现了灯盏细辛中含有较多的酚酸类化合物，其中包括了3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、飞蓬酯乙等，均表现出与灯盏乙素同等的生物活性，是灯盏细辛中一类重要的有效成分。因此，本研究对灯盏细辛中野黄芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸2种有效成分进行含量测定，为临床用药提供参考。

1　仪器与试药

1.1实验仪器：日本Agilent1100 series高效液相色谱仪，其中包括DAD检测器、四元泵、柱温箱、在线真空脱气机、自动进样器，色谱工作站为Agilent Chemstation色谱系统。美国梅特勒公司生产的电子分析天平（精密度为0.0001g），SZ-98型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣仪器厂），KQ5200型超声波清洗器（北京超声仪器公司）。

1.2实验试剂及试药：野黄芩苷对照品（生产批号120148-20150223）、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸（生产批号06-20120525，纯度≥98％）均购于中国食品药品检定所，实验用水为三蒸水，乙腈、甲醇溶液为色谱纯，其他试剂均为分析纯。灯盏细辛药材购于我市中药材收购站，并有专家鉴定为真品。灯盏细辛提取物为研究过程中自制（主要步骤为灯盏细辛药材适量，粉碎机碎成粉末后加入20倍量水浸泡40min后，煮沸提取60min，过1.5倍药材量的AB-8型大孔吸附树脂，以水洗至洗脱液无色，以5倍树脂体积的70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇洗脱液回收溶剂，减压干燥后研磨成粉末）。

2　方法与结果

2.1色谱条件的选择：色谱柱Dikma Kromasil C18（250mm× 4.6mm，5.0μm），流动相选择乙腈：0.2％磷酸溶液=30∶70，检测波长为332nm，柱温为35℃，进样量为15μL，以野黄芩苷的色谱峰作为参考，理论塔板数>4000，见图1。

2.2对照品溶液的制备：取2种有效成分对照品适量，精密称定后置于10mL容量瓶中，甲醇溶液定溶至刻度后即得对照品溶液，置于-20℃冰箱中保存备用。

2.3供试品溶液制备：取灯盏细辛提取物0.01g精密称定后置于50mL容量瓶中，甲醇溶液20mL，超声后放冷后甲醇溶液定溶至刻度，摇匀后过0.22μm微孔滤膜后，滤液即为供试品溶液。

2.4线性关系考察：分别取“2.2”项下的2种有效成分对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL置于10mL容量瓶中，甲醇溶液定溶至刻度后摇匀。按照“2.1”项下的色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，对照品含量为横坐标，得到线性回归方程分别为：野黄芩苷Y=1.554×103-0.201×102（r=0.9997），在0.0341～1.3121μg范围内线性关系良好；3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸Y=1.724×103-0.081× 102（r=0.9996），在0.0592～2.3426μg范围内呈良好的线性关系。

2.5精密度考察：精密吸取“2.2”项下的2种有效成分对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件重复进样5次，结果表明野黄芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸RSD值分别为1.24％、0.98％，表明仪器的精密度较好。

2.6稳定性考察：取灯盏细辛提取物，按照“2.3”项下的供试品溶液配制方法制成供试品溶液后分别在0、2、4、6、8、10、12、24、36h时按照“2.1”项下的色谱条件分别进样，结果表明野黄芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸RSD值分别为1.12％、0.85％，表明在36h内供试品溶液的稳定性较好。

2.7重复性考察：取同一批次的灯盏细辛提取物5份，按照“2.3”项下的供试品溶液制备方式配制成供试品溶液，测定野黄芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD值分别为1.32％、0.87％，表明该方法的重复性良好。

2.8加样回收率试验：取已知含量的样品4份精密称定，分别加入定量的野黄芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品，置于50mL容量瓶中，甲醇溶液定溶至刻度，摇匀静置后，按照“2.1”项下的色谱条件绘制色谱图，并根据线性回归方程计算含量，见表1。

表1　灯盏细辛提取物中2种有效成分加样回收率试验

2.9含量测定：取不同批次的灯盏细辛提取物，按照“2.3”项下的配制条件制备供试品溶液，测定3批灯盏细辛提取物中2种有效成分的含量，结果见表2。

表2　灯盏细辛提取物中2种有效成分的含量（n=3）

3　讨论

3.1流动相的选择：根据参考文献[4]，本试验研究中分别以甲醇：水、乙腈：水为流动相进行考察，结果表明因2种有效成分均为微酸性，流动相中需要加入一定量的酸以防止拖尾现象，所以在流动相中加入了0.2％磷酸溶液。实验表明，乙腈：0.2％磷酸溶液在30∶70时2种有效成分的色谱峰显著分离。

3.2检测波长的选择：实验中采用了DAD在220～400nm波长范围内进行紫外扫描，野黄芩苷和3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸的最大吸收波长范围在324～338nm之间[5]，在本次实验过程中选择332nm作为检测波长。

总之，采用高效液相色谱法测定灯盏细辛提取物中2种有效成分，操作简单，精密度好，重现性高，可以作为灯盏细辛提取物中这2种有效成分的定量分析方法。

[1]路雪倩，张富文，张艺，等.灯盏细辛总黄酮对视神经的保护作用[J].中药新药与临床药理，2011，22（5）：510-514.

[2]任琦，谢媛媛，祖双，等.灯盏细辛中多酚类成分定性、定量的分析[J].药物分析杂志，2013，33（7）：1175-1177.

[3]张静.灯盏细辛制剂神经保护活性-化学对比研究[J].成都中医药大学学报，2012，33（4）：68-71.

[4]杨菲，王智民.“一测多评”法测定丹参酚酸类成分的含量[J].中国中药杂志，2011，36（17）：2373.

[5]何兵，田吉，刘艳，等.高效液相色谱法同时测定楤木不同部位4种成分的含量[J].中国医院药学杂志，2011，31（21）：1820-1822.

The High Performance Liquid Chromatography in the determination of the content of two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract

Li Chunping Ou Chunyan（Dongshan County Hospital of Fujian province Dongshan 363400）

Objective：To investigate the High Performance Liquid Chromatography in the determination of the content o Scutellarin and Isochlorogenic acid B f two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract.Methods：The Column Selection was Dikma Kromasil C18（250mm×4.6mm，5.0μm），the mobile phase was acetonitrile：0.2％phosphoric acid solution=30∶70，the detection wavelength was 332nm，the column temperature was 35℃.Results：The scutellarin linear regression equation was：Y=1.554×103-0.201×102（r=0.9997）;Isochlorogenic acid B regression equation was：Y=1.724×103-0.081×102（r=0.9996）;scutellarin was at the range of 0.0341～1.3121μg，3，4-O-dicaffeoylquinic range was 0.0592～2.3426μg，which showed a good linear relationship.Conclusion：The HPLC method for the determination of the content of two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract is simple and easy operation，with high precision，reproducibility，and can be used as a quantitative analysis method for the two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract.

Erigeron breviscapus extract Scutellarin HPLC Isochlorogenic acid B

R927.2

A

1672-8351（2016）10-0008-02