二氧化硅/磁性石墨烯复合材料的制备及在MALDI-TOF MS检测喹诺酮类药物中的应用

张继东 ， 魏　河 ， 李勇强

(1.宁夏公安厅 物证鉴定中心 ， 宁夏 银川　750011 ； 2.陕西师范大学 化学化工学院 ， 陕西 西安　710062)



二氧化硅/磁性石墨烯复合材料的制备及在MALDI-TOF MS检测喹诺酮类药物中的应用

张继东1， 魏河2， 李勇强1

(1.宁夏公安厅 物证鉴定中心 ， 宁夏 银川750011 ； 2.陕西师范大学 化学化工学院 ， 陕西 西安710062)

采用MALDI-TOF MS质谱方法，以二氧化硅/磁性氧化石墨烯复合材料为富集和检测平台，建立了复杂样品中环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星三种药物的测定方法。实验结果表明二氧化硅/磁性石墨烯复合材料(Fe3O4/GO/SiO2)与传统基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)相比，对小分子的检测具有更好的灵敏度和信噪比。而且对于复杂样品无需预处理过程，可以对实际样品中的三种药物直接进行富集检测。

磁性石墨烯复合材料 ； 喹诺酮类药物 ； MALDI-TOF MS ； MALDI基质

喹诺酮类抗菌药是一种广谱的抗菌类药物，在临床治疗、鱼牧业养殖以及食品等方面具有广泛应用，为我们的健康和生活起到了积极作用[1-3]。然而，近年来由于我国抗生素的使用越来越频繁，人们对抗生素的耐受性逐渐提高，造成了免疫力下降，抗生素疗效减退的情况，对我国人民的生活健康产生了负面影响，同时在水产养殖、农牧业、乳制品等行业也存在一定的抗生素残留问题，严重威胁着人们的饮食安全和健康。因此建立复杂样品中喹诺酮类抗生素的简单、灵敏检测方法具有重要的意义[4]。

与LC-MS、GC-MS等质谱技术相比，MALDI MS对样品的前处理更简单，同时MALDI MS对盐的耐受性较高，对实际样品的分析便捷。

本研究利用二氧化硅/磁性石墨烯复合材料(Fe3O4/GO/SiO2)作为富集和检测平台，选取了环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星作为喹诺酮类药物代表物，对生物复杂样品中的多种喹诺酮类药物进行了快速检测。

1　仪器与试剂

仪器：德国Bruker公司MALDI-TOF MS质谱仪。

试剂、药物：甲醇(分析纯)、乙醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)；环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星和氧氟沙星(标准品，美国Sigma试剂公司)；α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA(标准品，美国Bruker公司)。

2　方法与结果

2.1质谱条件

本研究采用德国Bruke的MALDI-TOF MS质谱仪，配有波长为337 nm的脉冲氮气激光光源，应用模式为正离子反射模式，所有质谱图的激光照射次数皆为100次。仪器条件为：激光重复频率为50 Hz，延迟时间为190 ns，加速电压为20 kV。

2.2溶液配制

准确称取5 mg的环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星，分别配置成浓度为1 mg/mL的储备液，放于冰箱中备用。其中环丙沙星使用超纯水配制，诺氟沙星和氧氟沙星使用乙腈/水(1∶1，体积分数)配制。称取1.0 mg Fe3O4/GO/SiO2，将其分散于1.0 mL的乙醇/水中，超声30 min得到均匀溶液。用乙腈/水(1∶1，体积分数)做溶剂，配制CHCA的饱和溶液。

2.3材料的制备

通过Hummers法合成制备了氧化石墨烯(GO)，得到的GO与FeCl2·H2O通过氧化还原经过一步反应得到Fe3O4/GO，利用TEOS作为硅烷化试剂将SiO2包覆于Fe3O4/GO，得到 Fe3O4/GO/SiO2[5-8]。利用红外光谱(FTIR)对其官能团进行表征。

2.4红外光谱(FT-IR)表征

采用德国布鲁克红外光谱仪测试样品的组成。具体步骤：将溴化钾与干燥的GO和Fe3O4/GO/SiO2分别均匀混合后压片测试。红外光谱(FT-IR)的红外特征峰如图1所示。

图1　GO和Fe3O4/GO/SiO2的红外光谱图

2.5Fe3O4/GO/SiO2对环丙沙星吸附性能的研究

2.5.1磁性氧化石墨烯/二氧化硅复合材料的吸附动力学

为了研究得到的材料对药物的吸附速率，以环丙沙星为目标分子，绘制了其吸附动力学曲线，如图2所示。

图2　Fe3O4/GO/SiO2对环丙沙星吸附的动力学曲线

从图2中可以看出，在吸附开始阶段，磁性氧化石墨烯/二氧化硅复合材料对环丙沙星的吸附量迅速增加，此后随着时间的推移，吸附量的增速减缓，在110～120 min时已经基本达到平衡。在吸附过程的初始阶段，磁性氧化石墨烯/二氧化硅复合材料表面具有大量的吸附位点，环丙沙星分子能够迅速地吸附在Fe3O4/GO/SiO2表面，具有较大的吸附速率。然而随着时间的推移，磁性氧化石墨烯表面的吸附位点逐渐减少，被目标分子占据，材料对环丙沙星分子的吸附速率逐渐减小，吸附速率的增加也趋于平缓，最终达到平衡。

2.5.2静态吸附实验

为了研究磁性氧化石墨烯/二氧化硅复合材料对喹诺酮类药物的吸附性能，选取了环丙沙星作为喹诺酮类药物的代表，以磁性氧化石墨烯/二氧化硅复合材料作为吸附剂对环丙沙星进行吸附试验。图3为一定量的Fe3O4/GO/SiO2对梯度浓度的环丙沙星吸附2 h的吸附等温线，从图3中可以看出，Fe3O4/GO/SiO2对环丙沙星的吸附量随着环丙沙星的浓度增大而增加，而当环丙沙星的浓度达到一定程度时，Fe3O4/GO/SiO2对环丙沙星的吸附量保持不变，说明环丙沙星在Fe3O4/GO/SiO2表面的吸附趋于饱和。在环丙沙星的测量浓度范围内，根据Langmuir等温吸附方程，对环丙沙星的吸附等温曲线进行拟合，得到线性方程相关系数R=0.988 4。Langmuir方程拟合的良好的线性关系，说明环丙沙星在Fe3O4/GO/SiO2的吸附符合Langmuir吸附规律，表明环丙沙星在Fe3O4/GO/SiO2上的吸附过程以单分子层吸附为主。经过进一步的计算，得出磁性氧化石墨烯/二氧化硅复合材料对环丙沙星的最大吸附量为44.3 mg/g。

图3　Fe3O4/GO/SiO2对环丙沙星的吸附等温线

2.6分析喹诺酮类药物

以CHCA和Fe3O4/GO/SiO2作为MALDI基质，分别以环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星作为喹诺酮药物的分析对象，采用MALDI-TOF MS分点法分别点样，待其干燥后直接对其进行MALDI质谱分析。图4为Fe3O4/GO/SiO2作为MALDI基质检测三种药物的质谱图。从图4中可以观察到，CHCA作为基质时背景具有很强的离子干扰峰，由于样品信号峰淹没在大量强度较强的背景峰中，因而难以从图中准确归属信号峰。当以Fe3O4/GO/SiO2作为MALDI基质时，几乎没有产生背景离子干扰峰，同时三种药物的检测效果良好。其中环丙沙星的分子离子峰为[M+K]+， 诺氟沙星的两个分子离子信号峰分别为[M+Na]+和[M+K]+，而氧氟沙星的分子离子信号峰则为[M+Na]+的分子离子信号峰。实验结果表明，本试验所采用的Fe3O4/GO/SiO2作为MALDI 基质用于检测喹诺酮类抗菌药物具有良好的效果。

a.基质Fe3O4/GO/SiO2　b.环丙沙星　c.诺氟沙星　d.氧氟沙星；CHCA作为MALDI基质检测喹诺酮类药物　e.基质CHCA　f.环丙沙星　g.诺氟沙星　h.氧氟沙星

2.7实际样品中喹诺酮类药物的富集检测

将15%的TCA水溶液与牛奶按照1∶3的比例混合，加入药品，将涡旋振荡器调至五档后震荡1 min，然后静置10 min，使蛋白完全沉淀，再以9 000 r/min的转速离心20 min，取上清液待用。

将1.0 mg/mL的Fe3O4/GO/SiO2基质储备液超声10 min，得到均匀的基质溶液，取10 μL悬浮液立即加入到500 μL的分析溶液中，将混合的溶液超声15 min，利用磁性进行分离，移去上清液，将富集到分析物的Fe3O4/GO/SiO2再次悬浮于10 μL的乙醇/水(1∶1，体积分数)溶液中。最后，取1 μL的悬浮液直接点样于样品板上，在室温下自然挥干，进行MALDI-TOF MS分析。图5展示了牛奶中环丙沙星，以及尿液样品中的诺氟沙星和氧氟沙星在富集前后的质谱图。三种药物的信号强度与富集前相比显著增加，此现象表明了Fe3O4/GO/SiO2对环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星具有一定的吸附富集能力。环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星的富集倍数皆达到了50倍。因此，本研究所应用的Fe3O4/GO/SiO2，对于复杂样品中的多种喹诺酮类药物，作为富集材料和检测平台，在MALDI MS检测过程中展现出双平台的功能，简化了样品的预处理步骤，为喹诺酮类药物的快速检测提供了新的手段。

a.牛奶中环丙沙星富集前　b.尿样中诺氟沙星富集前　c.尿样中氧氟沙星富集前　d.牛奶中环丙沙星富集后　e.尿样中诺氟沙星富集后　f.尿样中氧氟沙星富集后

3　讨论

MALDI质谱常用的点样方法有两种：①分点法，即先将基质点于靶板上，待自然风干后再将待测样品点于板上；②混合点样法，将基质与样品溶液等量混合均匀，然后直接点于靶板上，待自然干燥后测量。相对于石墨烯作为基质，本研究使用的磁性氧化石墨烯/二氧化硅复合材料点板后能形成更加均匀的基质薄层，因而能量的吸收较好，同时能量的分布更加均匀，本实验采用分别点样法进行试验。

以Fe3O4/GO/SiO2作富集和检测的双功能平台对复杂样品中的喹诺酮类药物进行快速检测。Fe3O4/GO/SiO2基于氧化石墨烯功能化而来，具有和氧化石墨烯相同的二维层状结构，因此具有良好的吸附性能和能量传导性。与传统基质CHCA相比，Fe3O4/GO/SiO2对小分子的检测具有更好的灵敏度和信噪比。同时由于功能化过程中引入了Fe3O4磁性颗粒，与石墨烯和氧化石墨烯相比，Fe3O4/GO/SiO2大大缩短了样品的富集和前处理的时间，为复杂样品的应用提供了可能。同时，本研究制备的Fe3O4/GO/SiO2在最外层有硅包覆，因此在使用过程中磁性颗粒不易脱落，磁性不易衰减。因此，Fe3O4/GO/SiO2对复杂体系中的多种喹诺酮类药物进行富集，并直接用于MALDI-TOF MS检测，为喹诺酮类药物小分子快速分离检测和MALDI-TOF MS高通量分析提供了基础。

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Preparation of SiO2/ Magnetic Gagnetic Graphene Composites and Application in the Detection of Quinolones Drugs by MALDI-TOF MS

ZHANG Jidong1, WEI He2, LI Yongqiang1

(1.Institute of Forensic Science , Ningxia Public Security Bureau , Yinchuan750011 , China ；2.School of Chemistry and Chemical Engineering , Shanxi Normal University , Xi′an 710062 , China)

SiO2/Magnetic gagnetic graphene is applied as a MALDI matrix for the analysis of quinolones antibacterial drugs.The results show that these compounds could be successfully analyzed by MALDI -TOF-MS using the reported method. The new method not only shows good performance in quinolones drug analysis but also is a directly analysis method for complicated sample without any pretreatment.

magnetic graphene composites ; quinolone drugs ; MALDI-TOF MS ; MALDI matrix

2016-06-20

张继东(1970-)，男，高级工程师，从事刑事技术理化(毒物、毒品及微量物证)检验鉴定工作，电话：0951-6136223。

TQ050.43，TQ463.24

A

1003-3467(2016)09-0026-05