化痰法结合补气、活血法促进肝星状细胞系HSC-T6凋亡的实验研究*

宋春花，张志花，陈　涛，黄志华，常欣峰，尹　宝，陈荟瀛，周海倩，韩立民

(1.赣南医学院 a.第一附属医院，江西　赣州　341000;2.湖南中医药大学，湖南　长沙　410007)



化痰法结合补气、活血法促进肝星状细胞系HSC-T6凋亡的实验研究*

宋春花1a，张志花1，陈涛1，黄志华1，常欣峰1，尹宝2，陈荟瀛1，周海倩1，韩立民1

(1.赣南医学院 a.第一附属医院，江西赣州341000;2.湖南中医药大学，湖南长沙410007)

目的：观察化痰法结合补气、活血法对肝星状细胞系HSC-T6生长的抑制作用及对相关凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法：制备相关化痰法药物血清，采用MTT法检测各组含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响；AnnexinⅤ/PI双染法，流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡率；Western blot方法检测细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达情况。结果：MTT结果表明化痰法结合补气、活血法可有效抑制肝星状细胞HSC-T6的增殖；AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术检测结果表明化痰法结合补气、活血法可以促进HSC-T6细胞凋亡；Western blot 结果显示化痰法结合补气、活血法能降低细胞中Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，且Bcl-2/Bax明显下降。结论：化痰法结合补气、活血法可通过抑制Bcl-2蛋白表达、促进Bax蛋白表达来诱导HSC-T6细胞凋亡，进而发挥抗肝纤维化作用。

肝纤维化；化痰法；HSC-T6；Bcl-2；Bax

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。肝纤维化是肝硬化的必经阶段，并与肝癌有关。因此治疗肝纤维化对于预防肝硬化、肝癌有着十分重要的意义。中医认为，“痰瘀阻络、正气不足”是肝纤维化的基本病机，抗肝纤维化的中医药研究就是以其基本病机作为指导，然而既往的研究多从“活血化瘀”和“扶养正气”方面展开，从“化痰”角度开展的研究鲜有报道，有必要对其进行探索研究。为此，我们选取了化痰药物白芥子结合补气药物黄芪、活血药物丹参，制备相应含药血清，观察其对肝星状细胞系HSC-T6的影响并探讨作用机制。

1　材　料

1.1动物及细胞株雄性Wistar大鼠，清洁Ⅱ级，体重(150±30) g，购自赣南医学院实验动物中心；大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自上海中医药大学肝病研究所，赣南医学院科研中心传代培养。

1.2药品和试剂胎牛血清(Gibco，10099-141)、0.25%胰酶(Gibco，25200-056)、MTT Formazan(Sigma，M2003-1G)、PI Annexin Ⅴ apoptosis detection kit(美国BD公司，3018688)，Bcl-2抗体(Santa Cruz，Sc-492)、Bax抗体(Santa Cruz，Sc526)、BCA蛋白定量试剂盒购自天根生化科技有限公司(A：Lot#J9122；B：Lot#J8830)。

1.3仪器Ⅱ型水套式CO2培养箱(美国Thermo)，TS100-F型荧光倒置生物显微镜(日本尼康公司)，MK3型酶标仪(美国Thermo公司)，BD Calibur流式细胞仪(美国BD公司)化学发光成像系统和电泳、转膜系统(美国Bio-Rad公司)。

2　方　法

2.1各组中药制备化痰组：白芥子100 g；化痰结合补气组：白芥子100 g+黄芪150 g；化痰结合活血组：白芥子100 g+丹参150 g。以上3组中药于蒸馏水煮3次，每次煮开1 h，沙布过滤，合液后旋转蒸发仪浓缩至500 mL，即白芥子浓度为：0.2 g·mL-1；丹参及黄芪浓度为：0.3 g·mL-1。大鼠给药体积为1 mL·100 g-1，即白芥子每次给药剂量为2.0 g·kg-1，丹参及黄芪每次给药剂量为3.0 g·kg-1(给药量参照《中药药理实验方法学》体表面积剂量换算公式)。

2.2含药血清制备将80只清洁Ⅱ级Wistar雄性大鼠随机分成4组：A、正常对照组(Control)；B、化痰法组(白芥子组，B)；C、化痰结合补气法组(白芥子+黄芪，BH)；D、化痰结合活血法(白芥子+丹参，BD)，每组20只。 治疗组分别给予相关药物灌胃，1 mL·100 g-1，每日2次；正常组给予等剂量生理盐水灌胃，连续给药4天。于末次给药1 h后，1.5%的苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，无菌条件下，腹主动脉取血约10 mL，分离血清。将同组大鼠血清混匀，56 ℃，30 min水浴灭活，0.22 μm薄膜滤菌器过滤，-20 ℃保存。

2.3大鼠肝星状细胞系HSC-T6的复苏与培养HSC-T6细胞株复苏，CO2孵箱(5%CO2,37 ℃,95%湿度)传代培养，3代后用于以下实验。

2.4MTT法检测各组含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响待HSC-T6细胞形成单层，用0.25%胰蛋白酶消化，吹打均匀后加10%NCS的DMEM培养液悬浮细胞，将细胞数量调整为2.5×104·mL-1接种至96 孔培养板，每孔200 μL 细胞悬液，培养24 h细胞贴壁后，分4组(正常血清对照组，白芥子组，白芥子+黄芪组，白芥子+丹参组)，每组8个复孔，弃培养液, 分别加入正常大鼠血清，白芥子大鼠含药血清，白芥子+丹参大鼠含药血清，白芥子+黄芪大鼠含药血清，继续培养24 h、48 h、72 h后，加入0.5%的MTT(5 mg·mL-1)，每孔20 μL，37 ℃作用4 h，弃培养液，加入DMSO (二甲基亚砜) 100 μL，37 ℃、10 min轻轻摇动培养板，应用酶标仪检测570 nm波长处的光吸收值，计算公式：细胞增殖抑制率=[(对照孔测定的平均OD值-用药组测定的平均OD值)/对照孔测定的平均OD值]×100%。

2.5AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术检测HSC-T6细胞凋亡取处于对数生长期的细胞，常规消化，制成单细胞悬液。计数并调整剂量为4×104个·mL-1接种于60 mm2培养皿中，每皿5 mL(即2×105个·皿-1)，CO2培养箱(5%CO2,37 ℃, 95%湿度)中培养。培养24 h后见细胞贴壁生长状态良好, 弃培养液, 加10%NCS的DMEM培养液继续培养48 h。48 h后弃培养液，PBS清洗1次，加入200 μL 0.25%胰蛋白酶消化，镜下观察消化完全后，加入800 μL 10%NCS的DMEM培养液终止反应，重悬细胞后计数。收集细胞于1.5 mL EP管中，离心(1 000 r·min-1×5 min)，弃上清。PBS液清洗2次，离心(1 000 r·min-1×5 min)，弃上清。取适量AnnexinⅤ Binding Buffer 重悬，计数，调细胞剂量为1×106个·mL-1，取40 μL 细胞(即4×104个)放入离心管中。每管加AnnexinⅤ、PI各2 μL，混合后避光放置15 min，上机检测。

2.6Western Blot法检测肝星状细胞系HSC-T6细胞BcI-2、Bax蛋白水平的表达HSC-T6细胞经各组含药血清培养48 h后，裂解细胞，提取蛋白，BCA蛋白检测法进行蛋白定量。取50 μg蛋白，调整体积为24 μL，样品煮沸5 min，冰上放置5 min ，再6 000 r·min-1离心5 min，-80 ℃保存。电泳时取细胞蛋白放于沸水中煮5 min后放入冰盒内冷却5 min，4 ℃，6 000转离心5 min，经SDS/PAGE凝胶电泳，然后电转移至NC膜，封闭后，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h，增强化学发光试剂孵育1 min，超高灵敏度化学成像系统照相，图像软件测定灰度值。同样方法测定内参的光密度值，受检蛋白与相应β-actin的光密度值比值为该蛋白的相对光密度值。各组重复试验8次，每次以对照组条带相对光密度值为1进行数据标准化，所得8次数据进行统计学分析。

3　结　果

3.1各组含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响MTT试验结果表明，加药培养干预24 h、48 h、72 h后，各含药血清组对HSC-T6细胞生长均有一定的抑制作用，其中白芥子+丹参组效果最好。同时，随着作用时间的延长，细胞凋亡的数量增多，有时间依存性。而正常血清组细胞生长良好，各含药血清组与正常血清对照组比较有显著意义(P<0.01)。提示化痰法结合补气、活血法可有效抑制肝星状细胞系HSC-T6的增殖(见表1)。

表1　各组含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响

注：与正常血清组比较，**P<0.01。

3.2各组含药血清对HSC-T6细胞凋亡的影响实验结果表明，白芥子组、白芥子+黄芪组、白芥子+丹参组细胞凋亡率分别为：(16.46±1.49)%、(17.57±1.12)%、(19.04±1.43)%，与正常血清对照组(6.92±0.99)%比较有显著性差异(P<0.01)，提示化痰法结合补气、活血法可以促进HSC-T6细胞凋亡。同时，白芥子+丹参组与白芥子组比较有差异(P<0.05)，提示化痰结合活血法效果好于单纯化痰法(见图1～5) 。

3.3各组含药血清对相关凋亡蛋白的影响与正常血清组比较，各含药血清组中Bcl-2蛋白表达均降低，Bax蛋白表达则显著升高，有明显差异(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值亦明显下降(P<0.01)；各治疗组之间比较，白芥子组与白芥子+丹参组在Bcl-2蛋白表达上差异明显(P<0.05)；而在Bcl-2/Bax比值上，白芥子组与白芥子+黄芪组、白芥子+丹参组亦有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；各治疗组在Bax蛋白表达上则无显著性差异(P>0.05)。提示化痰法结合补气、活血法可以通过降低Bcl-2蛋白表达，增强Bax蛋白表达，调整Bcl-2/Bax比值，促进HSC-T6细胞的凋亡(见图6、图7)。

注：与正常血清组比较**P<0.01；与白芥子组比较，#P<0.05。

图1各组含药血清对HSC-T6细胞凋亡的影响

图2正常血清组 图3白芥子组

图4白芥子+黄芪组 图5白芥子+丹参组

注：与正常血清组比较*P<0.05，**P<0.01；白芥子组比较，#P<0.05，##P<0.01。

A、正常血清组，B、白芥子组，C、白芥子+黄芪组，D、白芥子+丹参组。

图7各组含药血清对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

4　讨　论

肝纤维化是肝细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激，大量纤维增生同时伴有纤维降解的相对或绝对不足，细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)在肝内大量沉积所致[1-3〗。中医认为，“痰瘀阻络、正气不足”是本病的基本病机，并以此为指导，临床上以“化痰活血、扶养正气”等为主要治法对肝纤维化及肝硬化进行治疗，疗效较好。然而，在有关药物抗肝纤维化的机制研究中，多以“活血化瘀”和“扶正”的中药为主，涉及“化痰”中药抗肝纤维化的机制研究鲜有报道。这表明之前的研究主要是从活血化瘀、扶养正气等方面展开的，对“化痰法”在治疗本病中的作用和机制研究还不够重视。这不仅不利于对本病基本病机科学性的全面认识，也在很大程度上阻碍了中医药抗肝纤维化优势的充分发挥。因此有必要对“化痰法”抗肝纤维化的作用及其相关机制进行研究探讨。

有关化痰药的选用，我们在长期临床的基础上，查阅了大量文献，认为“白芥子”是治疗肝纤维化的理想化痰药[4]。白芥子性味“辛温”， 入肝、脾、肺、胃、心与胞络之经(《本草新编》)，“味辛能散，性温能行”，能“通经络”(《得配本草》)，治胁下及皮里膜外之痰(《本草求真》)，有搜剔宣通之功，又不耗损肺、胃、肝、心之气，入于气分而实宜，即用于血分而亦当者也 (《本草新编》)。可见白芥子为治疗右胁下之肝纤维化的“痰浊阻络”之不二良药。同时由于肝纤维化属慢性难治性疾病，临床用药时间较长，选方用药应以“祛邪不伤正”为基本原则，白芥子没有半夏、南星的频用耗气之弊，且“无毒，……安五脏，……能消能降，能补能升，助诸补药，尤善收功”(《得配本草》)。现代研究[5]亦证实，白芥子能使试验小鼠前列腺组织中VEGF 和bFGF 表达显著降低，而VEGF 和bFGF 在肝纤维化中也是表达增加，是参与肝纤维化的重要细胞因子。

为此，我们以化痰中药“白芥子”为载体，通过其与补气中药黄芪、活血中药丹参相配伍组成“化痰法”，制备含药血清，对大鼠肝星状细胞系HSC-T6生长进行干预，初步探讨“化痰法”抗肝纤维化的主要作用及其初步机制。试验结果表明，化痰法结合补气、活血法能够有效抑制HSC-T6细胞增殖，促进其凋亡；进一步研究发现，化痰法结合补气、活血法可以通过降低细胞中抑凋亡蛋白Bcl-2表达，提高促凋亡蛋白Bax表达，调整Bcl-2/Bax比值来达到促进HSC-T6细胞凋亡，抗肝纤维化的目的。而化痰法结合活血法效果优于单纯化痰法，亦证明早期肝纤维化“痰瘀互阻”的基本病机理论。

综上，化痰法结合补气、活血法可通过抑制Bcl-2蛋白表达、促进Bax蛋白表达来诱导HSC-T6细胞凋亡，进而发挥抗肝纤维化作用。此结论深化了中医学对肝纤维化“痰瘀互阻，正气不足”基本病机理论中“痰阻”的认识，为肝纤维化从“痰”论治提供实验依据。

[1]FriedmanS L. Mechanisms of hepatic[J].Gastroenterology,2008,134(6):1655-69.

[2]彭岳，吴光，韦燕飞，等.桂郁金提取物对人肝星状细胞增殖、凋亡影响的研究[J].辽宁中医杂志，2011,38(11):2133-2135.

[3]黄艳，黄成，李俊.肝纤维化病程中Kupffer 细胞分泌的细胞因子对肝星状细胞活化增殖、凋亡的调控[J].中国药理学通报，2010,26(1):9-13.

[4]郑保平，姚乃礼.白芥子抗肝纤维化的理论探讨[J].时珍国医国药，2011, 22(11):2754-2755.

[5]陈密玉. 白芥子提取物对小鼠前列腺增生组织生长因子和雄激素受体表达的影响[D]. 福州：福建师范大学，2007.

The Method Resolving Phlegm, combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation Promotes Apoptosis of Hepatic Stellate Cell Line HSC-T6

SONGChun-hua1,ZHANGZhi-hua2,CHENTao2,HUANGZhi-hua2,CHANGXin-feng2,YingBao3,CHENHui-ying2,ZHOUHai-qian1,HANLi-ming2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity;2.GannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000;3.HunanUniversityofTraditionalChinesemedicine,ChangshaHunan410007)

Objective: To investigate the effect of a method, Resolving Phlegm, combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation, on proliferation and on the expression of apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax of hepatic stellate cell line HSC-T6. Methods: The sera of Resolving Phlegm related drug were prepared, and MTT method was used to detect the effect of serum with drug on the proliferation of HSC-T6 cells; Annexin V/PI staining, cell cycle and apoptotic rates were tested by flow cytometry. The protein levels of Bcl-2 and Bax were tested by Western-blot. Results: The method, Resolving Phlegm, Combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation, can effectively inhibit proliferation of hepatic stellate cell of HSC-T6 (MTT assay), promote HSC-T6 cell apoptosis (Annexin V/PI double staining), reduce the expression of Bcl-2 protein in the cells,increase the expression of Bax protein,and decreased the rate of Bcl-2/Bax(Western-blot). Conclusion: The method, Resolving Phlegm, Combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation, protects against liver fibrosis through inhibiting Bcl-2 protein expression and promoting the expression of Bax protein, thus inducing apoptosis of HSC-T6 cells.

Hepatic fibrosis;Resolving Phlegm;HSC-T6;Bcl-2;Bax

国家自然科学基金地方项目(81360521)；赣州市指导性科技计划项目(GZ2015ZSF308)

韩立民，男，教授，博士生导师。E-mail：jxhlm@163.com

R965

A

1001-5779(2016)04-0543-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.04.012

2016-04-13)(责任编辑：敖慧斌)