磁微粒-吖啶酯化学发光游离甲状腺素检测试剂的研制及应用

张建锋

(英科新创/厦门科技有限公司，福建厦门 361022)



·临床研究·

磁微粒-吖啶酯化学发光游离甲状腺素检测试剂的研制及应用

张建锋

(英科新创/厦门科技有限公司，福建厦门 361022)

目的研制定量检测游离甲状腺素的化学发光免疫试剂。方法制备吖啶酯-T4结合物作为信号标记物质，制备链霉亲和素-磁性微球作为固相载体，结合生物素标记的甲状腺素(T4)抗体，建立小分子竞争法免疫分析体系，分析其灵敏度、准确度和线性范围等性能指标。结果灵敏度为1.5 pmol/L，线性范围2～75 pmol/L，批内不精密度CV为5.62%～8.24%，批间不精密度CV为7.08%～9.82%，与T3和rT3无交叉反应，37 ℃ 6 d后发光值降幅为10.7%～14.6%，检测100例临床血清标本，测定结果与进口试剂的相关性r值等于0.924 5。结论该试剂具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好、受环境影响小、检测结果准确等特点，可配套全自动化学发光免疫分析系统，应用于临床检测。

游离甲状腺素；化学发光；吖啶酯；磁性微球

甲状腺素(T4)是甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素。体内游离的甲状腺素(FT4)通过维持体温及刺激热量生成来调节正常生长与发育，其含量与甲状腺功能状态密切有关。检测FT4 水平并结合其他甲状腺检验和临床表现，可对甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退作出诊断[1]。血清FT4检测方法有平衡透析法、放射免疫测定法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫分析法等[2-6]。其中化学发光免疫分析法是最具发展前景的新型非放射性免疫标记技术。本研究成功制备小分子-吖啶酯结合物，基于小分子物质的竞争法检测原理，研制定量检测FT4的磁性微球-吖啶酯标记-化学发光免疫分析试剂。报道如下。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂LB960型化学发光读数仪(Berthold公司)，2695-2696液相色谱仪(Waters公司)，DXI800全自动免疫分析系统(Beckman公司)。T4单抗、链霉亲合素(SA)购自罗氏公司；生物素、脱盐柱购自Thermo fisher公司；NSP-DMAE-NHS购自上海迈拓崴公司； T4标准品购自中国药品生物制品检定所；T4纯品、 BSA购自Sigma公司，临床标本来自福建医科大学附属协和医院。其他试剂均购自阿拉丁试剂公司。

1.2试剂组分制备

1.2.1SA磁性微球制备按照摩尔比2∶1称取适量氯化铁和氯化亚铁，在超纯水中溶解混匀后加入氨水至终浓度为0.5%，60 ℃搅拌反应4 h，所得磁性微球用超纯水洗涤后，重新分散于50%乙醇中，再依次加入0.5%的PEG4000、0.1%的氨水和0.1%的正硅酸乙酯，60 ℃搅拌反应16 h，获得改性后的磁性微球用超纯水和无水乙醇交替洗涤后，重悬于50%乙醇中，再分别加入0.05%的氨水、0.5%的四甲基氢氧化铵(TMA)和2.5%的3-氨丙基三甲氧基硅烷，室温搅拌反应16 h，即得表面修饰氨基的磁性微球。取适量该氨基磁性微球，用PBS缓冲液清洗并重悬，再加入0.1% TMA和2.5%的戊二醛，室温搅拌反应30 min，之后用碳酸缓冲液清洗并重悬，超声分散后按20 μg/mg磁性微球加入SA，37 ℃搅拌反应16 h，然后分别加入0.1%的谷氨酸和1%的BSA继续反应1 h， PBS缓冲液(含0.05%的tween-20)洗涤3次后，重悬于1% BSA中，超声分散，即得SA磁性微球。

1.2.2生物素化抗体制备取适量Anti-T4单抗，pH 7.4的PBS缓冲液透析纯化后，加入15倍(摩尔比)已活化的长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，2～8 ℃反应2 h，再转入室温继续反应30 min，最后加入100倍(摩尔比)的赖氨酸反应30 min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1% NaN3。

1.2.3吖啶酯-T4结合物制备称取T4纯品适量，溶于DMSO中，配制浓度为0.1 mmol/L的溶液A。再称取NSP-DMAE-NHS适量，溶于无水DMF中，配制浓度为10 mmol/L的溶液B。取溶液B 5.0 mL，加入三乙胺(TEA)2 mg，再加入溶液B 5.0 mL，最后用0.05 mol/L pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释至总体积10 mL，室温搅拌反应16 h，产物经制备色谱纯化，获得吖啶酯-T4结合物。

1.2.4FT4标准品配制称取适量T4标准品[7]，溶解于适量无激素血清中，配制成浓度为0.1 mmol/L的储备液，再用无激素血清将储备液稀释为S0、S1、S2、S3、S4、S5共6个校准点，浓度分别为0、2、5、10、25、75 pmol/L。

1.2.5底物激发液配制激发液A：0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3；激发液B：0.2 mol/L NaOH+2% Triton X-100。

1.3方法及原理微孔中依次加入50 μL 的标本、吖啶酯-T4结合物、生物素化抗体和SA磁性微球，37 ℃温育15 min，洗涤5次，加激发液A和B各100 μL，读取相对发光值。反应原理为一步竞争法。标本中待测的游离T4抗原与吖啶酯标记的T4抗原相互竞争结合有限的生物素化抗体，最终吖啶酯所产生的发光值与标本中的FT4含量呈反向相关。

2　结　　果

图1　　FT4测定标准曲线(剂量-反应曲线)

2.3特异度将易发生交叉反应的物质T3和rT3分别稀释至500 ng/mL和50 ng/mL，作为标本进行检测，高浓度T3和rT3对检测无明显干扰，其浓度均小于1.5 pmol/L。

图2　　热稳定性试验结果

2.4热稳定度将全套试剂组分37 ℃放置6 d后， 分析其标准品测试性能，通过与放置前的信号强度比值，确定热稳定性的变化幅度，均小于15%。见图2。

2.5准确度采用FT4标准品进行测试，使用Log-Logit数学模型拟合，分析实际测试值与理论值的偏差，准确度测试偏差小于10%。见表1。

表1　　准确度试验结果

2.6与其他厂家试剂的相关性用全套试剂对100例临床标本进行检测，高、中、低值标本分别为21、29、50例，与贝克曼DXI800全自动化学发光系统检测值进行比较，相关性较好(r2=0.854 7)。见图3。

图3　　与贝克曼全自动化学发光免疫分析系统的相关性

3　讨　　论

血液循环中绝大部分T4与载体蛋白相结合，只有0.03% 的T4 处于游离状态(FT4)。检测FT4不受甲状腺球蛋白影响，可特异性地反映甲状腺的功能状态，因此在疾病诊断、病情评估、疗效监测等方面具有重要的临床应用价值，成为判断甲状腺功能最灵敏的一项参考指标[8]。

目前有研究报道， FT4化学发光免疫检测方法的免疫固相载体主要有微孔和磁性微球2种[9-10]。磁性微球通过化学键偶联蛋白，具有结合牢固、重复性好、反应高效、易于储存和自动化等特点，是较为先进的固相载体。信号标记物主要是间接发光的酶标记，包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，而采用吖啶酯(AE)直接标记游离甲状腺素研究较少。AE标记物背景信号低、发光效率高，且不需要酶催化，受环境因素干扰较小，且其底物比酶促系统底物更加稳定[11]。因此，吖啶类物质作为信号标记物，对试剂的灵敏度、精密度等都有很大提高。

本研究成功将吖啶酯作为信号物质与小分子甲状腺素进行标记，采用小分子竞争法原理，引入磁性微球作为固相载体，并结合链霉亲和素-生物素系统，开发出性能优良的FT4检测试剂，具有重要的临床应用价值，对相关科研也有一定的参考意义。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.052

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1673-4130(2016)19-2773-03

2016-03-20

2016-05-25)