弱精子症患者与正常生育者精浆差异蛋白的研究

李旺胜,余　蕾

(1.贵州省六盘水市人民医院检验科　553401；2.贵州医科大学附属医院/贵州省产前诊断中心，贵阳 553001)



·临床研究·

弱精子症患者与正常生育者精浆差异蛋白的研究

李旺胜1,余蕾2

(1.贵州省六盘水市人民医院检验科553401；2.贵州医科大学附属医院/贵州省产前诊断中心，贵阳 553001)

目的研究弱精子症患者精浆差异蛋白的特征。方法选取六盘水市人民医院2015年1～12月就诊的200例弱精子症患者(研究组)，同时收集同期已婚生育健康男性200例(对照组)，采集所有研究对象的精液标本，采用Percoll技术获得精浆，酶解获得肽段,Shotgun技术检测蛋白质成分。比较2组标本唯一肽段数等于1但肽段总数大于或等于4、唯一肽段数大于或等于2的结果。结果2组标本唯一肽段数等于1但肽段总数大于或等于4、唯一肽段数大于或等于2情况下，有172种差异蛋白，其中研究组89种，对照组83种。研究组89种差异蛋白有3种与运动相关蛋白、3种细胞凋亡关联蛋白，分别为磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前体、相对分子质量为400×103的蛋白质，另有信号转导蛋白10种、细胞周期蛋白4种、结构分子7种、催化活性蛋白27种、分子功能未知蛋白19种、生物进程未知蛋白29种、细胞成分未知蛋白27种。酶催化活性、信号转导蛋白是常见差异蛋白。结论10种差异蛋白与弱精子症紧密相关，分别为膜联蛋白A4、蛋白S100-A9、蛋白S100-A11、维生素D结合蛋白前体、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶η前体、α辅肌动蛋白、胞质动力蛋白、相对分子质量400×103的蛋白质、白细胞介素-6受体β亚单位同工型1前体、联蛋白Ⅵ同工型2。

弱精子症；精浆；差异蛋白

Shotgun蛋白质检测技术又叫鸟枪蛋白质组学策略，该技术无需蛋白纯化步骤，可直接迅速鉴定蛋白混合标本中的蛋白质，消化作用将蛋白质处理成为多肽后，对多肽进行串联质谱测序分析，利用所得多肽波谱数据对数据进行搜索，特别算法得出肽段结构特征，从而区分蛋白质[1]。为了解弱精子症者精液蛋白差异，现对其与健康体检者进行检测对比。报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取六盘水市人民医院2015年1～12月就诊的200例弱精子症患者(研究组)，年龄22～39岁，平均年龄(29.4±3.2)岁。另选同期已婚生育健康男性200例(对照组)，均经过全面检测显示正常，年龄23～31岁，平均年龄(30.3±2.3)岁。2组研究对象均符合入选标准：研究组精子密度大于或等于50×106/mL,a级精子(快速前向运动)比例小于25%,且a+b级精子(前向运动)小于50%,其余指标符合WHO标准。对照组精液液化时间在30 min内，精子计数大于或等于20×106/mL,a级精子大于或等于25%,或a+b级精子大于或等于50%;正常形态精子比例大于或等于15%。2组研究对象的年龄、体质量等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法2组研究对象均禁欲1周，采集精液标本。根据WHO相关标准对标本黏稠度、凝集度、精子密度、液化时间、畸形率、存活率、活动度及白细胞水平、酸性磷酸酶、果糖进行检测。所有标本定量分装至100微克/管，混合后使用SDS-PAGE凝胶电泳分离处理，考马斯亮蓝染色胶体标本。获得分离图谱后，将泳道以手术刀切割分为4段，分置于试管内，采用100 mmol/L 的NH4HCO3/30%的ACN脱色处理，清洗去除上清液后将剩余部分冻干保存；加入DTT、NH4HCO3孵化30 min，孵化温度56 ℃，还原处理后去除上清液，各自将100 μL 100% ACN加入后等待5 min，吸除；各自加入30 μL 200 mmol/L IAA、70 μL 100 mmol/L NH4HCO3,避光静置20 min后，去除上清液部分，再次将10 μL的 NH4HCO3(100 mmol/L)加入,室温静置,去除上清液，将100 μL 100% ACN加入后等待5 min，吸除，冻干；将5 μL胰蛋白酶加入标本，4 ℃保存60 min，胶块膨胀后，根据实际体积加入缓冲液NH4HCO350 mmol/L，置37 ℃ 20 h，将酶解液吸除后移至清洁的EP管内，置入TFA、ACN，超声粉碎后将溶液吸除，向其中加入前次溶液，如此抽提重复3次，合并且冻干。毛细血管反相色谱、电喷雾线性离子阱质谱分析标本，并通过碎片图谱扫描、全扫描技术分析多肽及多肽碎片质量电荷比。结合分析结果对蛋白质库进行搜索，SEQUEST方法整合分析结果，从而获得蛋白质鉴定结果，并使用GOA软件对蛋白质进行分类鉴定。

1.3统计学处理采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析，计数资料对比应用χ2检验，计量资料比较使用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.12组研究对象精浆差异蛋白检测结果比较2组研究对象标本唯一肽段数等于1但肽段总数大于或等于4、唯一肽段数大于或等于2时，有172种差异蛋白，其中研究组标本有89种，对照组标本有83种。见图1～3。

图1　　精浆SDS PAGE谱图及切胶部位

图2　　对照组精浆蛋白MS-MS图

2.22组研究对象差异蛋白的功能分类2组标本差异蛋白采用GOA软件分类处理，表明研究组89种差异蛋白有3种运动相关蛋白、3种细胞凋亡关联蛋白，分别为磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前体、相对分子质量为400×103的蛋白质，另有信号转导蛋白10种、细胞周期蛋白4种、结构分子7种、催化活性蛋白27种、分子功能未知蛋白19种、生物进程未知蛋白29种、细胞成分未知蛋白27种。酶催化活性、信号转导蛋白是常见差异蛋白。

图3　　研究组精浆蛋白MS-MS图

3　讨　　论

临床研究者一致认可的蛋白质研究常见工具是Shotgun蛋白质组学策略，该方式主要借助LC-MS/MS串联质谱偶联液相层析技术完成混合物中蛋白质的鉴别，省去蛋白质纯化的时间和步骤[2-3]。鉴定到的蛋白质根据peptide counts和unique peptide counts这2个参数将其可信度分级:peptide是鉴定到的肽段总数(这里指重复肽段也被包含在内),非重复肽段即unique peptide counts是指某组、某种蛋白质特有的唯一肽段数，其中可信度最高的蛋白质为unique peptide counts大于或等于2类，其次为unique peptide counts等于1，再次为peptide counts大于或等于4类[4-5]。

人体精浆的蛋白有较大差别，本研究结合以往成功案例，对2组研究对象均使用混合同类标本进行鉴定，以保证整体研究的顺利进行和最终结果的可信度，同时增加对比研究，以提高标本例数缩小个体差异[6-7]。

本研究探讨弱精子症者精液蛋白差异，对研究组200例和对照组200例的精液标本蛋白进行检测比较，采用Percoll技术分离得到精浆、酶解获得肽段、Shotgun技术测定蛋白质成分，对比2组标本唯一肽段数等于1但肽段总数大于或等于4、唯一肽段数大于或等于2的结果[8-9]。 本研究结果显示，2组标本唯一肽段数等于1但肽段总数大于或等于4、唯一肽段数大于或等于2时，有172种差异蛋白，其中研究组89种，对照组83种。研究组89种差异蛋白有3种与运动相关的蛋白、3种细胞凋亡关联蛋白，分别为磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前体、相对分子质量为400×103的蛋白质，另有信号转导蛋白10种、细胞周期蛋白4种、结构分子7种、催化活性蛋白27种、分子功能未知蛋白19种、生物进程未知蛋白29种、细胞成分未知蛋白27种。酶催化活性、信号转导蛋白是常见差异蛋白。10种差异蛋白与弱精子症紧密相关，分别为膜联蛋白A4、蛋白S100-A9、蛋白S100-A11、维生素D结合蛋白前体、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶η前体、α辅肌动蛋白、胞质动力蛋白、相对分子质量400×103的蛋白质、白细胞介素-6受体β亚单位同工型1前体、联蛋白Ⅵ同工型2。

Shotgun鉴定方式也存在一定的局限性,该技术无法发现在表达丰度上有显著差异的蛋白质，提示本研究得到的172种差异性的蛋白质均为“有和无”的关系,这些蛋白质不能完全代表正常生育者精浆和弱精子症精浆蛋白质的差异性。进一步的功能鉴别分类则精细化地区别与病情有直接关联的差异性蛋白质[10]。

综上所述，弱精子症患者精液差异蛋白应着重与研究所示的172种差异蛋白进行鉴别和统计分析，筛选关联密切和重要度高的蛋白质，通过添加蛋白和封闭方式获取功能、去除功能，观察精子运动能力变化情况，精准寻找差异蛋白，为临床诊疗工作取得突破性的进展。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.044

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1673-4130(2016)19-2759-03

2016-04-21

2016-06-19)