IHC2+的胃癌患者HER2/neu基因的扩增情况研究

屠世晔，王晓凌，毛海波

(1. 奉化市中医医院， 浙江 奉化 315500；2.浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310009)

·基础与临床研究·

IHC2+的胃癌患者HER2/neu基因的扩增情况研究

屠世晔1，王晓凌2，毛海波1

(1. 奉化市中医医院， 浙江 奉化 315500；2.浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310009)

目的：研究IHC2+的胃癌患者HER2/neu基因的扩增情况。方法收集胃癌根治标本82例，经免疫组化证实均为IHC2+，对所有标本进行HER2/neu的FISH检测，比较两者结果的一致性。结果FISH检测显示82例IHC为2+的病例中,HER2/neu的阳性率为14.6%(12/82)；≥60岁患者HER2/neu的阳性率明显高于<60岁，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论对于IHC为2+的胃癌患者必须进行FISH检测以明确HER2/neu基因的扩增情况。

胃癌；HER2/neu; 荧光原位杂交；免疫组织化学

Abstract:[Objective] The study on the status of Her2/neu gene amplification in gastric cancer scored IHC2+. [Method] 82 cases of gastric cancer scored IHC2+ were collected. FISH was applied to determine the status of HER2/neu. The results were compared between these two methods. [Result] The positive rate of HER2/neu tested by FISH was 14.6% (12/82) in the 82 cases scored IHC 2+; The positive rate of HER2/neu in ≥60 years-old gastric cancers patients was significantly higher than that in <60 years-old patients (P<0.05). [Conclusion] FISH test was necessary for the patients with gastric cancer scored IHC2+, in order to define the status of HER2/neu amplification.

Keywords: gastric cancer;HER2/neu;immunohistochemistry;flourescence in situ hybridization

HER2/neu(又称c-erbB-2基因), 定位于人类染色体17q12-21.3，编码一种185 kd的跨膜酪氨酸激酶受体，是表皮生长因子受体(EGFRs)家族之一。HER2/neu在许多恶性肿瘤的发展过程中扮演重要角色。该受体蛋白与HER家族成员及其配体之间相互作用，通过细胞间的信号转导，调节细胞生长、分化和增殖[1]。近年来研究发现，HER2/neu基因的扩增和蛋白过表达广泛存在于各种上皮性肿瘤中，包括胃癌[2]。目前HER2/neu基因检测的常用方法是免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)，前者检测蛋白表达，后者检测基因扩增。由于检测方法、技术差异以及所选试剂等因素的影响，不同文献中胃癌HER2/neu阳性率高低不一，IHC检测的阳性率范围为6.8%～34.0%，FISH阳性率范围为7.1%～42.6%[3-4]。报道显示当HER2/neu免疫组化的结果为1+或者3+时，两种方法具有较高的一致性[5]。然而对于那些HER2/neu为2+的病例则无法直接判断HER2/neu基因的扩增情况。本研究主要探讨IHC2+的病例中，IHC和FISH两种方法对于检测HER2/neu基因的一致性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取奉化市中医医院2010年1月至2015年1月手术切除的胃癌根治标本82例，经免疫组化证实均为IHC2+，年龄37～86岁，平均年龄(63.5±6.2)岁，术前均未接受任何放化疗。

1.2 主要试剂

兔抗人HER2为北京中杉生物技术有限公司产品，FISH检测用HER2探针购自北京金菩嘉生物技术公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法(IHC) 标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片，采用Envision二步法染色。

1.3.2 荧光原位杂交(FISH) 组织切片，65℃过夜烘烤，二甲苯室温脱蜡2次，每次10min，梯度乙醇复水，高温下水煮30min，2XSSC漂洗2次，每次5min，37℃下于蛋白酶K工作液中孵育15min，2XSSC漂洗2次，每次5min，经-20℃预冷的70%、85%和100%乙醇各2min脱水，自然干燥，将玻片置于杂交仪上进行变性杂交，程序为83℃5min，42℃16h；程序结束后玻片经46℃预热的2XSSC/0.1%NP-40和2XSSC洗涤之后，经DAPI复染，于荧光显微镜下选择合适的滤光片观察。

1.4 结果判读

1.4.1 免疫组化法(IHC) 无染色或<10%肿瘤细胞膜染色为0；微弱或隐约可见≥10%肿瘤细胞膜染色或仅有部分细胞膜染色为1+；≥10%肿瘤细胞有弱至中等的基地侧膜、侧膜或完全性膜染色为2+；≥10%肿瘤细胞基底侧膜、侧膜或完全性膜染色为3+；≤10%肿瘤细胞基底侧膜、侧膜或完全性膜强染色为灶性3+。

1.4.2 荧光原位杂交(FISH) 计数20个细胞，统计Ratio值(Ratio值=20个细胞核中红信号总数/20个细胞核中绿信号总数)。Ratio<1.8为阴性结果，提示该样本无HER2基因扩增；Ratio≥2.2为阳性结果，提示样本中HER2基因发生扩增；Ratio在1.8～2.2之间时，增加计数细胞至40个，若比值≥2.0，则为阳性，比值<2.0，则为阴性。

1.5 统计学处理

采用SPPS13.0软件进行数据处理，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

本实验82例患者中，男性为60例，女性22例，有56.1%的患者≥60岁；56例标本肿瘤直径大于等于3cm；大部分肿瘤位于幽门部，占总数的65.9%；根据Lauren分型，肠型胃癌有35例，弥漫/混合型胃癌47例；低分化胃癌为34例；病理分级中III级比例最高为42.7%，而TNM分期中T4的比例是最高的，为52.4%；34例病例中未发现淋巴结转移。

经FISH检测，12例发现HER2/neu基因有扩增，阳性率为14.6%；≥60岁年龄组中，HER2/neu阳性率为21.7%(10/46),而<60岁年龄组中，HER2/neu阳性率为5.6%(2/36),2组间差异具有统计学意义；其他组间为发现HER2/neu与临床参数之间具有相关性(图1，图2，表1)。

图1：IHC和FISH检测结果. A: IHC HER2/NEU++;B: Fish(+),提示HER2基因有扩增

图2 IHC和FISH检测结果. C: IHC HER2/NEU++ ; D: Fish(-),提示HER2基因无扩增

临床资料HER2/neu阳性阴性总数χ2P年龄(岁)<6023436≥601036464.2340.0396性别男95160女319221.0000*肿瘤大小(cm)<342226≥3848561.0000*肿瘤部位贲门/胃体42428幽门846541.0000*Lauren分型肠型62935弥漫/混合型641470.3080.5791肿瘤分化高/中分化74148低分化529341.0000*病理分级Ⅰ+Ⅱ63844Ⅲ+Ⅳ632380.0760.7833TNM分期T131821T2-T4952611.0000*淋巴结转移N062834N1-N3642480.541*

注：*确切概率法

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，病死率高，尤其晚期患者传统治疗疗效差。多数研究证明肿瘤的发生、预后都与特定基因的过度表达有关。最近的一项Meta分析显示，HER2的过度表达与胃癌的Bormann分型、Lauren分型、肿瘤的分化程度、淋巴结的状态、静脉浸润等有关[6]。本实验中HER2/neu为IHC2+的胃癌患者并未发现与这些临床参数之间的相关性，但是患者年龄≥60岁与<60岁，HER2的表达是有统计学差异的，关于其中的分子机制，需要更多的基础研究来证实。在分子靶向治疗方面，曲妥珠单抗能有效地缓解胃癌患者的病情，因此准确地检测胃癌HER2/neu基因的扩增情况有助于对患者进行临床治疗和预后评估。

IHC和FISH是目前用于检测HER2/neu扩增状态的最常用方法。IHC检测的是蛋白水平，因成本低，用时短，易于操作，而且容易掌握，成为最常使用的筛选方法。但它有明显的缺点，结果受到很多因素的影响，如固定、修复方法、一抗的选择、人为主观判断等。FISH检测的是基因水平，是一种半定量的方法，减少了主观因素的干扰，因此结果更客观。它的缺点是成本高，耗时长，对操作人员的要求更严。基于FISH方法的敏感性和特异性，FISH成为判断HER2/neu基因的金标准。报道显示当HER2/neu免疫组化的结果为1+或者3+时，两种方法具有较高的一致性[5]。而当HER2/neu为IHC2+时，则无法直接判断HER2/neu基因的扩增情况，必须通过FISH检测明确HER2/neu是否存在扩增。本组研究表明，IHC2+的胃癌病例中HER2/neu阳性率为14.6%，≥60岁患者HER2/neu的阳性率明显高于<60岁，两者具有统计学意义(P<0.05)

综上所述，IHC为2+的胃癌患者联合FISH检测可以明确HER2/neu基因的扩增情况，为胃癌患者的预后及治疗方案提供有力的证据。

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ThestudyonthestatusofHer2/neugeneamplificationingastriccancerscoredIHC2+

TUShiye1,WANGXiaoling2,MAOHaibo1

(1.Traditional Chinese Midicine Hospital of Fenghua, Zhejiang 315500, China；2. The First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310009,China)

R446.8

B

1672-0024(2016)05-0049-04

屠世晔(1974-)，女，宁波奉化人，本科，副主任医师。研究方向：病理诊断