温度、pH及金属离子对大连虾蛄消化酶活性的影响

姜　鹤，孔繁东，刘兆芳

（大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

温度、pH及金属离子对大连虾蛄消化酶活性的影响

姜鹤，孔繁东*，刘兆芳

（大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

以大连虾蛄为原料，从肌肉及消化腺中提取消化酶（蛋白酶和淀粉酶），研究其酶学特性。结果表明，大连虾蛄肌肉中蛋白酶最适温度为50℃，最适pH为8，反应激活剂为Mg2+、Ca2+和Mn2+，抑制剂为Pb2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+；消化腺中蛋白酶最适温度为40℃，最适pH为6，EDTA对其有抑制作用，反应激活剂为Ca2+和Mn2+，抑制剂为Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+；大连虾蛄肌肉中淀粉酶最适温度为30℃，最适pH为7，反应激活剂为Mn2+，在浓度为20mmol/L时，激活作用最大，抑制剂为Pb2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+；消化腺中淀粉酶最适温度为30℃，最适pH为7，EDTA对消化腺淀粉酶有抑制作用，反应激活剂为Mn2+和高浓度Ca2+，抑制剂为Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+。

大连虾蛄；蛋白酶；淀粉酶；相对活性；温度；pH；金属离子

虾蛄又叫“虾爬子”、“螳螂虾”、“琵琶虾”、“虾虎”，属于节肢动物门，甲壳纲，口足目，虾蛄科，渤海湾一带数量较大，春汛4—7月、秋汛10—11月为捕捞的最佳时期［1-3］。虾蛄与其他品种相比，具有能自然越冬，抗害避难和养殖风险小的优点，值得推广养殖［4］。

大多数研究认为，消化酶活性是反映甲壳类动物摄食、营养条件、生理状况的良好指标。消化酶活性高低直接影响了甲壳动物对营养的吸收利用程度，进而影响其生长发育。大连虾蛄因其产地在大连渤海湾附近海域而得名，为重要的经济类海鲜。了解虾蛄体内消化酶的特性，对虾蛄的人工养殖具有重要的理论意义。试验以大连渤海湾虾蛄为研究对象，分别从虾蛄肌肉及消化腺中提取蛋白酶和淀粉酶，并对其特性进行研究，以期为人工饲料的配制和虾蛄的培育养殖提供一定的理论指导，同时为大连虾蛄的消化生理、营养生理的研究提供重要的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料与试剂

鲜活渤海虾蛄，2015年6月购于大连市海产品批发市场。

酪氨酸、干酪素、三氯乙酸、盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硫酸铵、福林酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、3，5-二硝基水杨酸、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、乙酸铅、硝酸镁、氯化钙、硫酸铁、EDTA等，均为国产分析纯试剂。

1.1.2仪器与设备

722型分光光度计，DK-S26型电热恒温水浴锅，JJ200Y型精密电子天平，CT14RD冷冻离心机。

1.2方法

1.2.1酶液提取

蛋白酶液提取：取虾蛄消化腺及肌肉组织与预冷Tris-Hcl缓冲液按照1∶3（m/V）的比例混合，玻璃研磨器研磨，高速冷冻离心（4℃，10 000 r/min）20min，取上清液。采用（NH4）2SO4二级沉淀法提纯，透析24 h后得蛋白酶液，冷藏备用［5-6］。

淀粉酶液提取：取虾蛄消化腺及肌肉组织与pH 7.2的预冷磷酸盐缓冲溶液以1∶10（m/V）的比例混合，用玻璃研磨器研磨，高速冷冻离心（4℃，10 000 r/min）

20min，取上清液作为淀粉酶粗提物，冷藏备用。

1.2.2酶活性测定

蛋白酶活性：以酪蛋白为底物，采用福林-酚法［7］测定。

淀粉酶活性：以淀粉为底物，采用3，5-二硝基水杨酸法测定。

1.2.3酶性质研究

1.2.3.1最适温度

将酶反应体系分别置于20、30、40、50、60、70、80℃恒温水浴，测定酶活性，确定最适温度。将酶活性最高的一组设为100%。为能直观看出各因素对酶活性的影响，本文一律采用相对酶活性。

1.2.3.2最适pH

将酶反应体系分别置于pH为5、6、7、8、9、10、11（pH 5～8的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸，pH 9～11的缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠），测定酶活性，确定最适pH。酶活性最高一组设为100%。

1.2.3.3EDTA和金属离子对酶活性的影响

在酶液中分别加入浓度为5、10、15、20 mmol/L的EDTA、硫酸锰、硫酸铜、乙酸铅、硫酸锌、硝酸镁、氯化钙、硫酸铁，室温放置30min后测定残余酶活性。以未经金属离子处理的酶液为对照组，其活性设为100%。

1.2.4数据处理

采用SPSS软件对数据进行统计分析，采用Excel软件作图。

2　结果与分析

2.1蛋白酶性质

2.1.1虾蛄蛋白酶最适温度的筛选

如图1所示，在温度为30～50℃范围内，肌肉中蛋白酶相对活性随着温度升高而升高，50℃时达到最高，然后随温度升高，蛋白质变性，导致酶活性明显下降［8-10］。消化腺中蛋白酶在温度为40℃时相对活性最高，之后随温度升高而降低。大连虾蛄肌肉中蛋白酶最适温度为50℃，这与沈文英等［11］研究的温度和pH对南美白对虾消化酶活性的影响结果中，南美白对虾蛋白酶最适温度为50～60℃相吻合，消化腺中蛋白酶最适温度为40℃。

2.1.2虾蛄蛋白酶最适pH的筛选

如图2所示，大连虾蛄肌肉中蛋白酶相对活性随着pH升高而增大，在pH为8时，相对酶活性最高；消化腺中蛋白酶在pH为6时相对活性最高。可见，肌肉中蛋白酶呈弱

碱性，消化腺中蛋白酶呈弱酸性，二者最适pH分别为8和6。消化腺中消化酶活性代表着虾蛄消化能力和消化率，据此建议在虾蛄饲料中可添加适量酸化剂，以增强酶活性，提高消化率，促进生长发育［12］。

2.1.3EDTA和金属离子对虾蛄蛋白酶活性的影响

如图3所示，随着EDTA浓度的升高，其对大连虾蛄消化腺蛋白酶活性的抑制作用显著增加。当EDTA浓度为20mmol/L时，对酶活性抑制率达到64%。

由表1可见，Mg2+、Ca2+和高浓度的Mn2+对虾蛄肌肉中蛋白酶活性有不同程度的促进作用。Mg2+浓度为20mmol/L时对酶活性促进作用最大，此时酶相对活性升高约51%；Ca2+浓度为5mmol/L时，对酶活性促进作用最大，酶相对活性升高约27%；Mn2+浓度为

20mmol/L时，对酶活性促进作用最大，酶相对活性升高约85%，由此推断该酶可能为一种金属蛋白酶，需要一定的辅助因子，如Mg2+、Ca2+和Mn2+来促进底物和酶活性中心的亲和力，从而提高酶活性［13-16］；在浓度为20mmol/L时，Pb2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对酶活性抑制作用大小排序为：Pb2+＞Zn2+＞Cu2+＞Fe2+。

表1　　金属离子对虾蛄肌肉中蛋白酶相对活性的影响Table 1　Effects of differentmetal ions on the relative activity ofprotease in themuscle ofmantis shrimp　　（%）

由表2可见，Mn2+浓度为15～20mmol/L时，对虾蛄消化腺蛋白酶活性有明显的促进作用，在浓度为

20mmol/L时，对酶活性促进作用最大，酶相对活性升高约42%；Ca2+在浓度为20mmol/L时对酶活性促进作用最大；Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对酶活性有不同程度的抑制作用，其中Cu2+、Zn2+、Fe2+浓度越大，对酶活性抑制作用呈增强趋势，浓度为20mmol/L时，抑制作用大小排序为：Cu2+＞Fe2+＞Pb2+＞Zn2+＞Mg2+。

表2　　金属离子对虾蛄消化腺蛋白酶相对活性的影响Table 2　Effects of differentmetal ions on the relative activity ofprotease in the digestive gland ofmantis shrimp　　（%）

2.2淀粉酶性质

2.2.1虾蛄淀粉酶最适温度的筛选

如图4所示，在温度为20～30℃范围内，肌肉及消化腺中淀粉酶相对活性随着温度升高而升高，在30℃时酶相对活性达到最高，然后随温度升高，蛋白质变性，导致淀粉酶活性明显下降。因此确定大连虾蛄淀粉酶最适温度为30℃。

2.2.2虾蛄淀粉酶最适pH的筛选

pH是影响酶活性的重要因素之一，主要通过两种途径改变酶活性，一是改变酶和底物的结合，二是改变酶的构象。如图5所示，在设定的pH范围内，大连虾蛄淀粉酶相对活性呈先升高后降低的趋势，肌肉和消化腺中淀粉酶在pH为7时，酶相对活性最高。可见大连虾蛄肌肉和消化腺中淀粉酶最适pH为7。

2.2.3EDTA和金属离子对虾蛄淀粉酶活性的影响

如图6所示，随着EDTA浓度的升高，其对大连虾蛄消化腺淀粉酶活性的抑制作用显著增加。当EDTA浓度为20mmol/L时，对酶活的抑制率达到70%。武忠亮等［17］研究表明，EDTA对烟草蔗糖酶有抑制作用。张勇侠等［18］的研究表明，EDTA对猪精液酸性磷酸酶有抑制作用，并认为EDTA由于鳌合酶活性中心的金属离子而使酶活性降低。由此推断，EDTA抑制蛋白酶和淀粉酶活性的主要原因是活性中心金属离子被EDTA鳌合所致。

由表3可见，Mn2+对大连虾蛄肌肉中淀粉酶活性有明显的促进作用，浓度为20mmol/L时，促进作用最大，酶相对活性升高约68%；Pb2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对淀粉酶活性有不同程度的抑制作用，其中Cu2+浓度越大对酶活性抑制作用越显著，在浓度为20mmol/L时，各金属离子抑制作用大小排序为：Zn2+＞Cu2+＞Pb2+＞Mg2+＞Ca2+＞Fe2+。

表3　金属离子对虾蛄肌肉中淀粉酶相对活性的影响Table 3　Effects of differentmetal ions on the relative activity ofamylase in themuscle ofmantis shrimp　（%）

由表4可见，Mn2+对大连虾蛄消化腺淀粉酶活性有明显的促进作用，浓度越高其对酶活性促进作用越强，浓度为20mmol/L时，促进作用最大，相对酶活性升高约215%；Ca2+在高浓度（15～20mmol/L）时，对酶活性表现为促进作用，15mmol/L时相对酶活性升高约93%；Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对酶活性有不同程度的抑制作用，Cu2+表现为浓度越高，抑制作用越明显，在浓度为20mmol/L时，抑制作用大小排序为：Fe2+＞Pb2+＞Zn2+＞Cu2+＞Mg2+。有毒金属离子与酶之间可能存在着某种作用形式，即有毒金属离子置换酶活性中心的必需金属或有毒金属离子结合酶分子中的咪唑基、巯基、羟基、氨基、肽基等功能基团，从而导致酶失活［19］。

表4　金属离子对虾蛄消化腺淀粉酶相对活性的影响Table 4　Effects of differentmetal ions on the relative activity of amylase in the digestive gland ofmantis shrimp　（%）

3　结论与讨论

上述试验结果表明，大连虾蛄的蛋白酶特性为：①肌肉中蛋白酶最适温度为50℃；最适pH为8；反应激活剂为Mg2+、Ca2+和Mn2+，当Mg2+和Mn2+浓度为

20mmol/L时，对酶活性促进作用最大，Ca2+浓度为5mmol/L时，对酶活性促进作用最大，推断该酶可能为一种金属酶；抑制剂为Pb2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+。②消化腺中蛋白酶最适温度为40℃；最适pH为6；EDTA对其有抑制作用，Ca2+和Mn2+浓度为20mmol/L时，对酶活性促进作用最大，Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对酶活性有不同程度的抑制作用。蛋白酶在不同部位最适pH不同，而消化腺蛋白酶最适pH为6，与南美白对虾胃内pH（5.4～5.5）相接近［20］，表明虾蛄消化腺蛋白酶在偏酸性条件下活性较高。因此，在虾蛄养殖过程中可适当添加酸化剂，提高其消化酶活性。

大连虾蛄淀粉酶特性为：①肌肉中淀粉酶最适温度为30℃；最适pH为7；反应激活剂为Mn2+，在浓度为20mmol/L时，激活作用最大；抑制剂为Pb2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+。②消化腺中淀粉酶最适温度为30℃；最适pH为7；EDTA对消化腺淀粉酶有抑制作用，反应激活剂为Mn2+和高浓度Ca2+（15～20mmol/L），Ca2+浓度为15mmol/L时促进作用最大，抑制剂为Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+。大多数甲壳类动物淀粉酶的最适pH偏酸性或中性，在pH 5～7范围内［15］，本试验中大连虾蛄淀粉酶最适pH为7，与甲壳类动物淀粉酶性质研究结果相一致。

以上研究均在试验规定的反应时间条件下进行，但实际虾蛄体内酶起作用的时间要长得多，所以最适温度只在一定条件下才有意义，在一定程度上反映消化酶的耐热性和温度对酶活性的影响规律。温度通过影响动物消化器官中消化酶活性来影响食物的消化吸收，最终影响其生长发育。因此，应根据环境温度的变化，及时调整饲料配方和投喂方式，从而提高营养物质的消化吸收能力，促进人工养殖的快速、健康发展。

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Effectsof Tem perature，pH and M etal Ion on the Activity of Digestive Enzyme from Dalian M antis Shrim p

JIANG He，KONG Fan-dong*，LIU Zhao-fang
（Schoolof Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

The properties of digestive enzymes（protease and amylase）were investigated existing in themuscle and digestive gland of Dalianmantis shrimp.The results showed that，in themuscle of Dalianmantis shrimp，the optimal temperature for protease was 50℃，the optimal pH was 8，the protease was activated by Mg2+，Ca2+and Mn2+，declined by Pb2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.In the digestive gland of Dalian mantis shrimp，the optimal temperature for protease was 40℃，the optimal pH was 6，EDTA could inhibit the enzyme activity，protease was activated by Ca2+and Mn2+，and declined by Pb2+，Mg2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.In themuscle of Dalian mantis shrimp，the optimal temperature for amylase was 30℃，the optimal pH was 7，amylase was activated by Mn2+at high concentration，when the concentration of Mn2+was 20 mmol/L，the activating effectwas the largest，and declined by Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.In the digestive gland of Dalian mantis shrimp，the optimal temperature for amylase was 30℃，the optimal pH was 7，EDTA could inhibit the enzyme activity，amylasewas activated by Mn2+and high concentration of Ca2+，and declined by Pb2+，Mg2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.

Dalianmantis shrimp；protease；amylase；relative activity；temperature；pH；metal ion

S917

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.015

姜鹤（1989—），女，汉族，硕士在读，研究方向：蛋白质资源开发利用。

孔繁东，硕士，教授，研究方向：蛋白质工程。

2016-04-22