文心兰类原球茎的愈伤组织诱导及其植株再生

黄　霞， 卢　禹

( 中山大学 生命科学学院 / 广东省热带亚热带植物资源重点实验室， 广州 510275 )



文心兰类原球茎的愈伤组织诱导及其植株再生

黄霞*， 卢禹

( 中山大学 生命科学学院 / 广东省热带亚热带植物资源重点实验室， 广州 510275 )

该研究首次以文心兰的类原球茎(protocorm-like bodies, PLBs)为外植体进行愈伤组织诱导及其植株再生培养，并分析了不同浓度的TDZ和2,4-D配比对愈伤组织增殖的影响。结果表明：以1/2MS为基本培养基，添加1 mg·L-1TDZ与3 mg·L-12,4-D，从接种的 PLBs上可以诱导出乳白色的、较疏松的愈伤组织，诱导频率达到100%。愈伤组织继代培养时，在2,4-D浓度为0.5～2.0 mg·L-1的范围内，其增殖主要受TDZ浓度的影响，TDZ浓度从1.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1，愈伤组织鲜重增殖倍数显著增加，由最低的4.50倍增加到最高的6.04倍。愈伤组织增殖的最适培养基为1/2MS + 0.5 mg·L-1TDZ + 1.0 mg·L-12,4-D。将在最适愈伤组织增殖培养基上继代培养约1个月的愈伤组织转移到T2培养基(3.5 g·L-1花宝1号 + 20 g·L-1红薯 + 25 g·L-1香蕉 + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel)上，黑暗培养1个月后，每克鲜重的愈伤组织约诱导出1 328.67个PLBs。将诱导出的PLBs转移到新鲜的T2 培养基上光照培养1个月，萌发率为90.12%。而将小植株转移到添加1 g·L-1活性炭的1/2MS培养基上，成苗率达到100%。该研究结果成功建立了文心兰的高频愈伤组织诱导及其植株再生体系，为文心兰基因工程育种提供了一个高效、稳定的转化受体系统。

文心兰, 组织培养, 愈伤组织增殖, TDZ, 再分化

文心兰又名舞女兰、 跳舞兰, 属兰科(Orchidaceae)文心兰属 (Oncidium)，原产于美洲的热带和亚热带地区(Chase et al，2009)。文心兰主要作为切花和盆花生产，其花分枝良好、花形优美、花色亮丽，且可连续开花，具有较高的观赏价值和较强的市场竞争力，尤其是在欧美市场中成为畅销的盆花种类之一。与其它兰科植物相同，由于传统分株繁殖系数较低，业界主要利用组织培养技术进行文心兰种苗繁殖(崔广荣，2010)。有关文心兰离体快速繁殖技术的研究大都是针对试管苗工厂化生产而进行的，主要集中于研究如何从外植体直接诱导出PLBs、PLBs增殖及植株再生。以文心兰的花梗及其花芽(彭晓明等，2000；钟士传和曹善东，2002)、茎(芽)尖(Lim-Ho，1981；彭晓明等，2000)、根尖(Kerbauy，1984)或叶片(Chen et al，1999)等组织器官为外植体，均可诱导出PLBs，建立文心兰离体再生体系。在此基础上，成功的文心兰基因转化系统均以PLBs为转化受体，但以PLBs作为转化受体得到的转基因植株多是嵌合体，而且转化效率较低(Liau et al，2003；You et al，2003；Raffeiner & Serelc，2009；林吾睿等，2012；Lee et al，2015)。由愈伤组织诱导形成PLBs多为单细胞起源(Jheng et al，2006)，因此，以愈伤组织为转化受体，对于提高转化效率和获得稳定遗传目的基因的纯合子非常有利。虽然以文心兰的茎切段(Chen & Chang，2000)、根尖(Chen et al，2000；Wu et al，2004)和茎尖(Jheng et al，2006)等为外植体，可诱导出愈伤组织并实现了植株再生，但其愈伤组织诱导频率低、周期长，而且愈伤组织难以保持胚性状态。

文心兰(Oncidium‘Gower Ramsey’)是一种观赏性较高、市场竞争力较强的兰花。基因工程育种技术为观赏植物的品种改良提供了有效途径，而以愈伤组织为转化受体有利于转基因植株的获得。目前以文心兰的茎切段、根尖和茎尖等为外植体，已成功诱导出愈伤组织并获得了再生植株，但存在愈伤组织诱导频率低、周期长，而且愈伤组织难以保持胚性状态等缺点。本研究以文心兰PLBs作为外植体进行愈伤组织诱导及其植株再生培养，研究影响愈伤组织增殖的因素，从而为文心兰基因工程育种提供一个高效、稳定的转化受体植株再生体系。

1　材料与方法

1.1 材料

所用的外植体为文心兰PLBs，由本实验室从文心兰腋芽中诱导得到后，通过继代培养保存。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织诱导用解剖刀将培养4周左右的文心兰PLBs分成单个，分别接种于愈伤组织诱导培养基CIM1和CIM2上，置于黑暗中培养1个月，培养温度为 (26±2)℃。每种培养基接种30个外植体，实验重复3次。

图版 Ⅰ　文心兰PLBs的愈伤组织诱导和植株再生　A. 用于愈伤组织诱导的文心兰PLBs; B. PLBs于CIM1培养基上诱导出的愈伤组织; C. B中愈伤组织的放大图; D. PLB于CIM2培养基上诱导出的愈伤组织; E. D中愈伤组织的放大图; F. 于1/2MS+0.5 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 2,4-D培养基上继代培养28 d的愈伤组织; G. PLB诱导培养4周后形成白色的PLBs; H. 白色的PLBs于光下培养，变绿萌发; I. 壮苗培养2个月得到可移栽的再生植株。Plate Ⅰ　Callus induction and plant regeneration from the PLBs of Oncidium ‘Gower Ramsey’　A. PLBs used for callus induction; B. Callus induction from PLBs on CIM1 medium; C. Enlarged view of the callus showed in B; D. Callus induction from PLBs on CIM2 medium; E. Enlarged view of the callus showed in D; F. Callus subcultured on 1/2MS medium supplemented with 0.5 mg·L-1 TDZ and 1.0 mg·L-1 2,4-D for 28 d; G. White PLBs produced from callus after four weeks; H. White PLBs turned green and germinated under the light; I. Healthy plants obtained after two months.

根据Jheng et al(2006)和Chen & Chang(2000)的报道，以及我们前期的预实验，选用的愈伤组织诱导培养基组成分别为(1)CIM1：以NDM (Tokuhara et al，1993) 作为基本培养基，添加1 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、1 g·L-1tryptone、20 g·L-1蔗糖和3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5；(2)CIM2：以1/2MS作为基本培养基，添加1 mg·L-1TDZ、3 mg·L-12,4-D、1 g·L-1tryptone、20 g·L-1蔗糖和3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5。

1.2.2 愈伤组织继代培养将CIM1上诱导出的愈伤组织转移至新鲜的CIM1上，而将CIM2上诱导出的愈伤组织转移至添加不同浓度 TDZ 和 2,4-D(如表1所示)的愈伤组织继代培养培养基1/2MS + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel(pH 5.5)上，每个培养皿中放置0.5 g 左右的愈伤组织，3个培养皿为一重复，置于 (26±2)℃，黑暗培养四周后统计实验结果，以筛选出愈伤组织增殖较快的培养基。实验重复3次。

1.2.3 PLBs的诱导与萌发愈伤组织于1.2.2筛选出的最适愈伤组织增殖培养基上， 每隔1个月继代培养1次，取第3次继代培养1个月左右的愈伤组织分成直径约5 mm的团块，转移到T2培养基(3.5 g·L-1花宝1号 + 20 g·L-1红薯 + 25 g·L-1香蕉 + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5)上(Chan et al, 2005)，每个培养皿接种0.5 g 左右的愈伤组织，3个培养皿为一重复，置于 (26±2)℃，黑暗培养1个月后统计结果。实验重复3次。将诱导出的PLBs转移至新的T2培养基上，(26±2)℃，1 000～1 500 lx，每天16 h光照培养。

表 1　不同培养基组成对文心兰愈伤组织增殖的影响

注： 同列中不同小写字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。愈伤组织鲜重增殖倍数为继代培养28 d的愈伤组织鲜重增加量与接种时的愈伤组织鲜重的比值。

Note: Different small letters in the same column indicate significant differences, while the same letters indicate no significant difference (P>0.05). Proliferation rate of callus fresh weight means the ratio of increased callus fresh weight to initial callus fresh weight after subculture for 28 d.

1.2.4 壮苗PLBs萌发后，将小苗转移到壮苗培养基上，(26±2)℃，1 000～1 500 lx，每天16 h光照培养。壮苗培养基组成为以1/2MS为基本培养基，添加20 g·L-1蔗糖、1 g·L-1活性炭和3 g·L-1phytagel， pH 5.7。

为提高受试者依从性和数据记录的准确性，推荐使用《受试者日志》，并明确日志卡的注意事项及日志卡问题的完整说明。根据有效性评价需要，患儿和（或）其监护人应在日志中，选择并及时记录以下内容：每日的SBM情况、大便性状、排便疼痛、FI次数、憋便次数、腹痛，以及用药、补救药物使用和如厕训练等情况。

1.3 统计分析

使用Excel 2007和 SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，平均值以平均数 ± 标准误表示，采用邓肯氏新复极差检验法(Duncan’s multiple ranger test)进行多重比较。

2　结果与分析

2.1 不同培养基对文心兰PLBs愈伤组织诱导的影响

分别于两种培养基上黑暗培养1个月后，100% 的PLBs诱导出愈伤组织(图版Ⅰ：B，D)，但不同培养基组成所诱导出的愈伤组织状态有差异。在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培养基上，PLBs诱导出淡绿色的、较致密的愈伤组织，质地偏硬(图版Ⅰ：C)；而在1/2MS + 1 mg·L-1TDZ + 3 mg·L-12,4-D培养基上，PLBs诱导出乳白色的、较疏松的愈伤组织，质地较软(图版Ⅰ：E)。

2.2 不同培养基对文心兰愈伤组织继代培养的影响

将诱导出的愈伤组织分别转移到相同组成的新鲜培养基上进行继代培养，结果发现愈伤组织在1/2 MS + 1 mg·L-1TDZ + 3 mg·L-12,4-D培养基上几乎不增殖，而在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培养基上增殖迅速，黑暗培养28 d愈伤组织鲜重增加了7.26倍。在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培养基上的愈伤组织生长虽然比较快，但其比较致密、质地偏硬，不能进一步诱导出PLBs从而获得再生植株。因此，我们重点研究以1/2MS为基本培养基时，TDZ和2,4-D的不同浓度配比对愈伤组织增殖的影响。

结果如表1所示，以1/2MS为基本培养基时，在2,4-D浓度为0.5～2.0 mg·L-1范围内，愈伤组织增殖主要受TDZ浓度的影响。当培养基中的TDZ浓度从1.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1，愈伤组织鲜重增殖倍数显著增加(由最低的4.50倍增加到最高的6.04倍)；而保持培养基中的TDZ浓度不变，在一定范围内添加不同浓度的2,4-D，愈伤组织鲜重增殖倍数并没有显著变化。

2.3 文心兰愈伤组织诱导PLBs及PLBs萌发的结果

愈伤组织于T2培养基上黑暗培养三周后，肉眼可见其表面形成白色的PLBs(图版Ⅰ：G)。诱导培养1个月后统计发现每克鲜重的愈伤组织约诱导出(1 328.67 ± 198.58)个PLBs。

移至光下培养，培养物逐渐变绿，1个月后可看到PLBs萌发(图版Ⅰ：H)。萌发率为(90.12 ± 3.65)%。

2.4 文心兰壮苗培养的结果

将PLBs萌发后得到的小植株转移到壮苗培养基中，光照培养约2个月，得到可以移栽网室的健壮再生植株(图版Ⅰ：I)。成苗率达到100%。

3　讨论与结论

基因工程育种是培育新品种的有效手段之一，文心兰转基因研究中几乎都是以PLBs作为转化受体，由于颗粒较大的PLBs是一个分化程度较高的个体，因此以其作为转化受体材料很容易获得嵌合体，使转化效率普遍较低(崔广荣，2010；Lee et al，2015)。由愈伤组织诱导形成PLBs多为单细胞起源(Jheng et al，2006)，以愈伤组织为转化受体，对于提高转化效率和获得稳定遗传目的基因的纯合子非常有利。因此，不少研究者致力于建立文心兰的愈伤组织诱导及其植株再生体系，虽有成功的报道，但一直未能应用到文心兰的基因转化中，究其原因主要是愈伤组织诱导频率低、获得再生能力所需时间较长且状态难以维持。

以文心兰的茎切段(Chen & Chang，2000)、根尖(Wu et al，2004)、茎尖(Jheng et al，2006)和叶(Chen & Chang，2000)为外植体，均可诱导出愈伤组织，其中根尖较叶片、茎段愈伤组织诱导频率高，最高也只达到25%。其诱导出的绿色、较致密的愈伤组织需要在降低2,4-D和TDZ浓度的培养基上继代3次以上才可得到具有再生能力的乳白色、较疏松的愈伤组织。而本试验以PLBs为外植体的愈伤组织诱导频率为100%，在添加了1 mg·L-1TDZ和3 mg·L-12,4-D的 1/2MS培养基上可诱导出乳白色、较疏松的愈伤组织。另外，已有研究发现愈伤组织在继代培养中容易分化出PLBs或芽，而且容易出现褐化死亡现象，这对愈伤组织的大量增殖非常不利，更是阻碍了在文心兰转基因操作中的应用。本试验中愈伤组织继代培养阶段并未观察到褐化现象，也无PLBs或芽的分化，而降低TDZ浓度有利于愈伤组织增殖。

已有报道表明，文心兰愈伤组织再生时需要添加植物生长调节物质，细胞分裂素和生长素的种类及浓度配比大大影响愈伤组织的再生频率(Wu et al，2004；Jheng et al，2006)。来源于PLBs的愈伤组织在不含有植物生长调节物质而添加了20 g·L-1红薯和25 g·L-1香蕉的培养基中，即可重新诱导出PLBs。由此可见，培养材料来源不同，即使是相同的培养目标，培养基的成分也有很大差异。

总而言之，本研究成功建立了一个高效的文心兰愈伤组织诱导及其植株再生体系，可望应用于文心兰的基因工程育种。

CHAN YL, LIN KH, SANJAYA, LIAO LJ,et al, 2005. Gene stacking inPhalaenopsisorchid enhances dual tolerance to pathogen attack [J]. Transgenic Res, 14 (3): 279-288.

CHASE MW, WILLIAMS NH, DE FARIA AD,et al, 2009. Floral convergence in Oncidiinae (Cymbidieae; Orchidaceae): an expanded concept ofGomesaand a new genusNohawilliamsia[J]. Ann Bot, 104(3): 387-402.CHEN JT, CHANG C, CHANG WC, 1999. Direct somatic embryogenesis on leaf explants ofOncidiumGower Ramsey and subsequent plant regeneration [J]. Plant Cell Rep, 19 (2): 143-149.

CHEN JT, CHANG WC, 2000. Efficient plant regeneration through somatic embryogenesis from callus cultures ofOncidium(Orchidaceae) [J]. Plant Sci, 160 (1): 87-93.

CUI GR, 2010. Research progress onOncidiumin tissue culture and transgens [J]. Acta Pratac Sin, 19 (4): 220-229. [崔广荣, 2010. 文心兰组织培养及转基因研究进展 [J]. 草业学报, 19 (4): 220-229.]

JHENG FY, DO YY, LIAUH YW, et al, 2006. Enhancement of growth and regeneration efficiency from embryogenic callus cultures ofOncidium‘Gower Ramsey’ by adjusting carbohydrate sources [J]. Plant Sci, 170 (6): 1 133-1 140.

KERBAUY GB, 1984. Plant regeneration ofOncidiumvaricosum(Onchidaceae) by means of root tip culture [J]. Plant Cell Rep, 3 (1): 28-29.

LEE SH, LI CW, LIAU CH, et al, 2015. Establishment of anAgrobacterium-mediated genetic transformation procedure for the experimental model orchidErycinapusilla[J]. Pant Cell Tiss Organ Cult, 120 (1): 211-220.

LIN WJ, CHEN CL, CHANG C, et al, 2012. TransformingFibrillingene intoErycinapusilla[J]. Hortic NCHU, 37 (4): 37-51. [林吾睿, 陈俊麟, 张正, 等, 2012.Fibrillin基因转殖到扇形文心兰(Erycinapusilla) 之研究 [J]. 兴大园艺, 37 (4): 37-51.]

LIAU CH, YOU SJ, PRASAD V,et al, 2003.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of anOncidiumorchid [J]. Plant Cell Rep, 21 (10): 993-998.

PENG XM, ZENG SJ, ZHANG JL, et al, 2000.Invitropropagation ofOncidiumby bud and inflorescence culture [J]. Acta Hortic Sin, 27 (2): 127-129. [彭晓明, 曾宋君, 张京丽, 等, 2000. 文心兰的茎尖及花梗组织培养和快速繁殖 [J]. 园艺学报, 27 (2): 127-129.]

RAFFEINER B, SEREK T, 2009.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of anOncidiumandOdontoglossumorchid species with the ethylene receptor mutant geneetrl-1 [J]. Plant Cell Tiss Org Cult, 98 (2): 125-134.

WU IF, CHEN JT, CHANG WC, 2004. Effects of auxins and cytokinins on embryo formation from root-derived callus ofOncidium‘Gower Ramsey’ [J]. Plant Cell, Tiss and Org Cult, 77 (1): 107-109.

YOU SJ, LIAU CH, HUANG HE, et al, 2003. Sweet pepper ferredoxin-like protein (pflp) gene as a novel selection marker for orchid transformation [J]. Planta, 217 (1): 60-65.ZHONG SC, CAO SD, 2002. The technology study on tissue culture and rapid propagation ofOncidium[J]. J Linyi Teach Coll, 24 (6): 34-36. [钟士传, 曹善东, 2002. 文心兰微体快速繁殖技术的研究 [J]. 临沂师范学院学报, 24 (6): 34-36.]

Callus induction and plant regeneration ofOncidium‘Gower Ramsey’ by means of protocorm-like body culture

HUANG Xia*, LU Yu

(GuangdongKeyLaboratoryofPlantResources,SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity, Guangzhou 510275, China )

Oncidium‘Gower Ramsey’ is a species of orchid with high ornamental value and strong market competitiveness. Gene engineering breeding technology provides an effective way for the genetic improvement of ornamental plants. And callus is an ideal transformation receptor. Up to now, callus induction and plant regeneration ofOnciudiumhave been successfully achieved using stem segment, root tip and shoot tip. But there are some shortcomings for theseinvitroregeneration systems, such as low frequency and long period of callus induction, difficulty in maintaining embryogenic state of callus, etc. In this research, for the first time protocorm-like bodies ofOncidium‘Gower Ramsey’ were used as explants for callus induction and plant regeneration. The effects of different concentrations and combinations of TDZ and 2,4-D on callus proliferation were investigated. The results showed that 1/2MS medium supplemented with 1 mg·L-1TDZ and 3 mg·L-12,4-D could promote the induction of whitish and friable callus, the induction rate was 100%. The proliferation rate of callus was mainly affected by the concentration of TDZ, while the callus subculture medium consisted of TDZ in combination with 2,4-D at the concentrations of 0.5 to 2.0 mg ·L-1. When the concentration of TDZ decreased from 1.0 to 0.5 mg·L-1, proliferation rate of the callus fresh weigh increased significantly. And the optimal medium for callus proliferation contained 1/2MS basal medium, 0.5 mg·L-1TDZ and 1.0 mg·L-12,4-D. After four weeks of subculture in the dark, the highest proliferation rate of the callus fresh weigh, which was 6.04 folds, appeared on the optimal medium, while the lowest proliferation rate of the callus fresh weigh, which was 4.50 folds, appeared on the medium containing 1/2MS basal medium, 1.0 mg·L-1TDZ and 2.0 mg·L-12,4-D. The callus subcultured on the optimal proliferation medium for about one month were transferred to T2 medium (3.5 g·L-1Hyponex 1 + 20 g·L-1sweet potato + 25 g·L-1banana + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1sucrose + 3.5 g·L-1phytagel) and cultured in the dark for PLBs induction. Approximately, 1 328.67 protocorm-like bodies could be generated in one month from an initial culture of 1 g callus fresh weight. Subsequently, the cultures transferred onto the fresh T2 medium. The germination rate of protocorm-like bodies was as high as 90.12% after one month of culture under the light. When transplanted on 1/2MS medium supplemented with 1 g·L-1active carbon, all shoots became healthy plants after two months. In this study, the callus induction and plant regeneration system ofOncidium‘Gower Ramsey’ with high frequency was successfully developed to provide an efficient and stable transformation receptor system for the genetic transformation ofOncidium.

Oncidium‘Gower Ramsey’, tissue culture, callus proliferation, TDZ, redifferentiation

10.11931/guihaia.gxzw201501038

2015-01-28

2015-08-07

国家“十二五”科技支撑计划项目(2013BAD01B0702)[Supported by the National Key Technology R & D Program during the Twelfth Five-year Plan Period (2013BAD01B0702)]。

黄霞(1974- )，女，广东廉江市人，博士，副教授，研究方向为植物生理与分子生物学，(E-mail)huangxia@mail.sysu.edu.cn。

Q945

A

1000-3142(2016)09-1082-05

黄霞， 卢禹. 文心兰类原球茎的愈伤组织诱导及其植株再生 [J]. 广西植物， 2016， 36(9):1082-1086

HUANG X, LU Y. Callus induction and plant regeneration ofOncidium‘Gower Ramsey’ by means of protocorm-like body culture [J]. Guihaia， 2016， 36(9):1082-1086