MshB基因突变对维罗纳气单胞菌菌毛动力的影响

杨秦

（邵阳医学高等专科学校 湖南邵阳 422000）

MshB基因突变对维罗纳气单胞菌菌毛动力的影响

杨秦

（邵阳医学高等专科学校 湖南邵阳 422000）

目的：通过探索野生型（菌毛表达）和MSHB基因突变型（菌毛不表达）维罗纳气单胞菌动力方面的差别，证明菌毛在细菌运动方面的重要功能。方法：首先培养细菌长至对数生长期，让后进行半固体培养基穿刺与平板挖沟培养实验，最后对阳性率进行T分析。结果：两者之间具有显著差别（P＜0.05）。结论： 菌毛对维罗纳菌的动力具有重要作用。

维罗纳气单胞菌 MSHB 动力

维罗纳气单胞菌是人畜共患病菌种。它和弧菌亲缘关系较近，曾近一度认为是弧菌科家族。脂多糖、菌毛、S-layer、细胞毒素、蛋白酶等［1-2］等都是细菌常见的致病因子。本次工作的目的是通过MSHB基因野生型（有菌毛）和突变型（无菌毛）菌毛形成能力的差别，研究菌毛对于细菌动力能力的影响，为了解维罗纳气单胞菌的致病能力和药物开发做基础性研究。

1 材料和方法

1.1 细菌种类

野生型（MSHB+）和MSHB基因突变型（MSHB-）维罗纳气单胞菌均复苏自-80℃。菌株均来自之前实验成果。MSHB基因为菌毛蛋白基因。之前实验已经证明突变型的菌毛蛋白不表达，故而野生型有菌毛而突变型无菌毛［3］。

1.2 细菌培养基和生长条件

BHIB（Brain Heart Infusion Broth）培养基用作此次细菌的培养基。37℃培养过夜培养。待测试OD570=2.0左右（即对数生长期细菌），取出细菌用作后继实验。

1.3 半固体培养基穿刺培养实验

传统半固体培养基有配制半固体干粉培养基购自天津市津东天正精细化学试剂厂，并严格按照其说明书要求配制。装入试管成3厘米高的半固体培养基，锡箔纸封口后高温灭菌。取对数生长期细菌接种半固体培养基， 从中央穿刺试管琼脂的3/4，37 ℃培养，24～72 h 观察结果。以细菌离开穿刺线生长， 扩散到培养基中使培养基变混浊为动力阳性， 细菌沿穿刺线生长，周围培养基仍保持澄清为动力阴性。每种菌株重复50次。

1.4 平板挖沟培养实验

鲜血琼脂平板购买自上海抚生生物科技有限公司。以无菌手术刀在鲜血琼脂平板中央挖去一条1cm宽的琼脂条，形成一条小沟，放置一条4cm×0.5cm的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使之与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种细菌的纯培养物，置37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至7天，如接种端的隔沟对边亦生长同样细菌，表示该菌有动力。每种菌株重复50次。

1.5 SPSS统计分析。

每种使用SPSS19.0进行相关统计分析。

2 结果

图1：A：半固体穿刺培养动力阳性。B半固体穿刺培养动力阴性。A试管中可见动力线浑浊，细菌向穿刺线周围生长。证明其具有动力。B试管穿刺线清晰，细菌无动力。

表1：野生型和突变型维罗纳气单胞菌动力测试。半固体培养基穿刺实验及平板挖沟培养实验（共50支）均证明野生型（有菌毛）比突变型（无菌毛）维罗纳气单胞菌有更多的阳性率。野生型与突变型之间有显著差别（P＜0.05）.菌毛在其运动中起到很重要的作用。

半固体培养基穿刺平板挖沟培养菌株 　　野生型（M s h B +） 　　突变型（M s h B -） 　　野生型（M s h B +） 　　突变型（M s h B -）总数（支） 　5 0 　5 0 　5 0 　5 0阳性（支） 　4 9 　4 0 　5 0 　3 7

3 讨论

细菌的动力具有重要的病理学意义。本次实验通过菌毛蛋白不表达的MSHB基因突变型维罗纳菌与菌毛蛋白表达的野生型之前的对比，发现菌毛在维罗纳气单胞菌的运动能力中起的重要的作用。尽管在大多数细菌依靠鞭毛进行动力，但细菌也依靠菌毛动力［4-5］。IV型菌毛是普遍的用作动力的结构［6-7］。本次实验所用维罗纳气单胞菌的菌毛便是属于IV型菌毛。IV型菌毛的动力功能一直没有直接证据，直到Hong S等［8］用tethering assay第一次直接证明IV型菌毛参与细菌的动力。IV型菌毛通过划（Social Gliding Motility）和蹭动（twitching motility）移动，比如粘球菌用IV型菌毛进行划行，假单胞菌和奈瑟菌依赖IV型菌毛进行蹭动［3，9］。IV型菌毛是很多致病病原体，比如霍乱弧菌、致病大肠杆菌［10-11］等和用来定植与黏附在上皮细胞上的的结构。相对于鞭毛的研究，菌毛的动力和生物膜方面研究相对较少。通过这次研究进一步证明菌毛在细菌动力方面的重要作用，为将来其生物膜形成及耐药性方面的研究也奠定了初步基础。

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Q2

A

1674-2060（2016）02-0019-02

1.2015年湖南省教育厅科研课题（15C1255） 2.2015年度湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（653）

杨秦（1981—），男，讲师，主要研究方向为生物化学与分子生物学。