人类白细胞介素-2与白细胞介素-7对体外诱导抗原肽SLYNTVAT 特异性T淋巴细胞的影响

朱建蒙

（广西医科大学 广西南宁 530000）

人类白细胞介素-2与白细胞介素-7对体外诱导抗原肽SLYNTVAT 特异性T淋巴细胞的影响

朱建蒙

（广西医科大学 广西南宁 530000）

目的：优化人类白细胞介素-2（rhIL-2）与白细胞介素-7（rhIL-7）在体外诱导培养SLYNTVAT（SL9）抗原特异性T细胞时的用量。方法：分离健康人外周血PBMC作为效应细胞，培养T2（TAP缺陷T淋巴细胞）细胞并加载HIV来源抗原肽作为刺激细胞。SL9抗原肽四聚体检测不同细胞因子用量下特异性T细胞诱导频率大小。结论：rhIL-7在诱导SL9抗原特异性T细胞中起到关键促进作用，SL9 特异性T淋巴细胞能够自身分泌大量rhIL-2，减少rhIL-2用量可为体外诱导培养SL9特异性T淋巴细胞提高效率。

SLYNTVAT 特异性T淋巴细胞 白细胞介素

通过长期混合淋巴细胞培养的方法能够诱导出同种抗原肽-MHC特异性的T 细胞［1］，肽四聚体技术目前被看做检测特异性CTL的金标准方法［2］。一般研究者体外诱导特异性CTL时均认为rhIL2在维持T细胞的生长增殖中起到重要作用，为诱导特异性CTL必不可少的细胞因子［3］。本研究通过加入不同量rhIL-2与rhIL-7进行混合淋巴细胞培养诱导SL9抗原特异性T细胞，构建SL9抗原肽四聚体并检测不同细胞因子用量下特异性T细胞诱导频率。证明rhIL-7在诱导SL9抗原特异性T细胞时起到更重要作用。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂

T2细胞购自于上海复祥生物科技有限公司，RPMI Medium 1640从Gibco公司购买，胎牛血清为Hyclone公司生产。PE标记链酶亲和素抗体购自于Sigma公司，生物素化MHC-SL9肽四聚体单体由北京旷博生物公司合成。PBMC来源于HLA-A2阳性志愿者外周血，无血清淋巴细胞培养基购自于照生公司，淋巴细胞分离液由索来宝公司提供。抗原肽SL9由杭州中肽公司合成。

1.2 抗原肽SL9加载T2细胞

培养T2细胞，调整细胞浓度为1×106/ml备用。在24孔板中，每孔加入1ml调整浓度后的T2细胞。各孔中加入特异性抗原肽SL9，终浓度40μg/ml。6 h后X射线200Gy辐照，1500rpm 5min离心收集细胞，无血清1640培养基重悬备用。

1.3 混合淋巴细胞培养诱导SL9特异性CTL

健康人外周血Ficoll-Hypaque法分离PBMC后在塑料培养瓶中贴壁2 h得到T淋巴细胞。加载SL9抗原肽T2细胞与PBL（外周血T淋巴细胞）以1：10的比例在完全T淋巴细胞培养基中混合培养。混合淋巴细胞分为三组培养。第一组：每三天加入rhIL7（终浓度10ng/ ml），每一周用加载SL9抗原肽T2细胞重新刺激。第二组：开始培养的三天加入rhIL2（终浓度50U/ml），三天后加入rhIL7；以后每三天轮流加入rhIL2或rhIL7。第三组：开始培养的三天加入rhIL2，以后每三天均加入rhIL7。

1.4 流式细胞仪检测SL9特异性CTL

T细胞用CD8单克隆抗体与PE-MHC肽四聚体染色后，流式细胞仪检测双染阳性频率。用Graphpad进行统计分析。

2 结果

抗原肽SL9加载T2细胞可稳定表达HLA-1类分子，第三组诱导方案可得到最大量特异性CTL，经过两周的诱导最大特异性CTL检测频率为12.4%。

图1 加载SL9抗原肽的T2细胞可稳定表达HLA-I类分子

图2 统计数据表明经过两周培养后，第三组混合淋巴细胞特异性CTL频率最高，即在诱导最初加入rhIL-2，以后每三天均加入rhIL-7，最高检出频率为12.4%。

3 讨论

抗原特异性T细胞在疾病发生发展中起到关键性作用［4］。在H I V病毒感染后长期无病程进展的患者血中可检测到高频率的CD8+T细胞［5］。对抗原特异性T细胞的研究有利于研究病毒性疾病病理进展和疫苗开发。HIV p17Gag蛋白来源抗原肽SLYNTVATL有着严格的生物学限制性，研究表明当HIV病毒产生对SL9特异性CTL产生免疫逃避后，将引起患者病毒大量复制［6］。提高SL9特异性CTL体外诱导效率可能有助于对疾病机理的研究与治疗。

［1］Y.J. GUO， Y. ZHU， S.H. SUN. Identification and functional studies of HLA-A0201 restricted CTL epitopes in the X protein of hepatitis B virus. Acta Virol 2011， 55（2）：107-15.

［2］Dries Van Hemelen， Vera Mahler， Gottfried Fischer， et al. HLA-class II peptide tetramers vs. allergen-induced proliferation for identification of allergen-specific CD4 T cells.Allergy. 2015 Jan；70（1）：49-58.

［3］Angel Varela-Rohena1， Peter E Molloy2， Steven M Dunn，et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nat Med. 2008 Dec；14（12）：1390-5.

［4］Goulder， P.J. & Watkins， D.I. HIV and SIV CTL escape： implications for vaccine design.Nat. Rev. Immunol. 2004 4， 630 640.

［5］Varela-Rohena A， Molloy PE， Dunn SM，et al. Nat Med. 2008 Dec；14（12）：1390-5.

［6］Morikawa， Y.， Zhang， W.H.， Hockley， D.J.， Nermut， M.V. & Jones，I.M. Detection of a trimeric human immunodeficiency virus type 1 Gag intermediate is dependent on sequences in the matrix protein， p17. J. Virol. 1998 ，72， 76597663.

Q2

A

1674-2060（2016）02-0324-01