三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应

苏连水，杨桂玲，吴声敢，皮天星，王强,*

1.南京农业大学植物保护学院农药系，南京210095

2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021

三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应

苏连水1,2，杨桂玲2，吴声敢2，皮天星2，王强2,*

1.南京农业大学植物保护学院农药系，南京210095

2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021

近年来农药复配使用成为普遍现象，它对生态的危害是否有别于农药单独使用？采用OECD人工土壤法，通过急性毒性、回避行为及抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性3个生态响应水平，研究三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应。结果表明：三唑磷对蚯蚓7 d和14 d的半数致死浓度(LC50)分别为331.1 mg·kg-1和122.0 mg·kg-1；氯氟氰菊酯对蚯蚓7 d LC50和14 d LC50分别为897.9 mg·kg-1和656.7 mg·kg-1。2种农药按毒性比1:1复配，表现为协同作用。三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓48 h的半数回避浓度(AC50)分别是41.6 mg·kg-1和6.0 mg·kg-1，两者亦表现为协同作用。经2种农药单独处理，蚯蚓体内CAT活性呈现轻微上升后下降，而POD和SOD活性无明显变化；复配导致POD活力显著上升，而CAT和SOD活力则显著下降。研究表明：三唑磷和氯氟氰菊酯复配呈现协同作用，增强彼此对蚯蚓的毒性作用，增大土壤生态危害风险；联合效应的产生与其阻断神经传导这一共同靶标有关。

三唑磷；氯氟氰菊酯；次子爱胜蚓；急性毒性；联合毒性；抗氧化酶活性

苏连水,杨桂玲,吴声敢,等.三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应[J].生态毒理学报，2016,11(3):294-301

Su L S,Yang G L,Wu S G,et al.The single and joint toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11 (3):294-301(in Chinese)

农药混合污染联合效应广泛存在，传统意义只关注单一毒性效应而忽视联合毒性效应的评价，低估了污染物危害风险和潜在威胁。许多研究表明，重金属与重金属，农药与重金属，农药与农药之间对鱼类[1]、蚤类[2]、蚯蚓[3]及哺乳类[4]等生物具有明显的联合毒性效应。研究生产常见混配农药间联合作用效应，正确评估多种污染物同时存在的生态健康风险得到越来越多的关注。

现阶段，通常依据农药对一系列生态系统中的代表性动物来评估农药的生态风险。蚯蚓是土壤生物量最大的无脊椎动物，在土壤物理性质的改良以及植物营养循环方面具有重要作用[5]。利用蚯蚓指示土壤污染状况，已经成为土壤污染生态毒理诊断的一个重要指标[6]。目前大多数研究只考虑急性暴露条件下污染物对蚯蚓的致死效应[7-8]，但是污染物在非致死条件下对蚯蚓的亚急性毒性效应，如行为、抗氧化酶、繁殖等[9-12]更接近实际生态系统中低剂量污染物对蚯蚓的长期毒性效应，然而目前这方面研究还比较薄弱，在农药生态风险评估上应用很少。

拟除虫菊酯农药是土壤中普遍残留的典型内分泌干扰物(EDCs)[13-14]，EDCs对人类健康和生态系统的危害在国际上日益受到关注[15]，在我国菜地土壤中检出率高达60%[16-17]；有机磷农药在农业生产占农药使用量60%～70%[18]。拟除虫菊酯和有机磷的二元混配是常见的混配方式，在混合农药中占有重要地位[19]。目前还没有三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的毒性效应相关研究报道。

本文选用赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)为供试生物，研究三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的急性毒性、回避行为及抗氧化活性联合效应。通过不同的实验对2种农药的联合毒性效应进行比较全面的评估，旨在了解农药复配后对蚯蚓的毒性影响的变化，对复合生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 实验材料

赤子爱胜蚯蚓(Eisenia foetida)，购买于浙江大学动物科学院蚯蚓养殖场。先预养一段时间，再挑选2月龄以上，环带明显，体重300～400 mg的健康蚯蚓作为供试生物。

试剂：85%三唑磷原药，95%氯氟氰菊酯原药，由浙江新农化工农药有限公司提供。3种抗氧化酶试剂盒及蛋白定量测试盒，购自于南京建成生物研究所。

仪器：紫外分光光度计(TU-1810PC，北京普析通用仪器有限责任公司)；水浴锅(Hestion，TEC 2601，常州思琳医用仪器有限公司)；搅拌机(ISO-679，无锡市建工试验仪器设备有限公司)；超声波清洗器(KQ2200，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 人工土壤法

人工土壤根据OECD guideline 207提供方法配制[20]。将药剂用丙酮和吐温溶解后拌于10 g石英砂中，待丙酮完全挥发后与490 g人工土壤混匀，加入蒸馏水，使土壤含水量为35%左右。将上述含药剂的土壤放入500 mL标准玻璃瓶中，再向玻璃瓶中加入10条在未经农药处理的人工土壤中驯养1 d的蚯蚓。用塑料薄膜封住玻璃瓶瓶口，然后用解剖针把塑料薄膜扎孔后置于(20±1)℃，湿度为80%～ 85%的恒温箱中连续光照培养(光照强度为400～ 800 lx)。每种药剂设6个浓度，每个浓度设3个重复，同时设1个不含药剂的空白对照组。试验第7天和14天各计数1次，记录死亡数及中毒症状，以蚯蚓前尾部对机械刺激无反应视为死亡。

1.2.2 回避行为实验法

将容器中放置一隔板，将其分为2部分。在其中一侧加入清洁土壤500 g(干重)，另一侧加入含有已知浓度的含药剂处理的土壤500 g(干重)，加入蒸馏水混匀，使土壤含水量为35%左右，抽去隔板，将15条蚯蚓放入原隔板处，以薄膜封顶防止蚯蚓逃出反应容器，用解剖针把薄膜扎孔，48 h后将隔板插入原位置，阻止蚯蚓进一步逃逸，手动挑出两侧土壤中蚯蚓。在48 h内，蚯蚓反应体系温度保持在(20± 1)℃，光照强度为400～800 lx。

1.3 联合毒性评价方法

按改进的Marking联合效应的相加指数法(Additional Index)进行评定[21]。根据公式求S：S=Am/Ai+Bm/Bi，式中，S为各毒物的毒性相加之和；Ai，Bi为单一农药的LC50；Am，Bm为复配农药中各单一农药的LC50。当S≦1时,AI=1/S-1.0；当S>1时,AI= 1.0-S。用相加指数(AI)评价农药的联合效应：AI> 0.25时为协同作用；AI<-0.2时为颉抗作用；当-0.2< AI<0.25时为相加作用。

1.4 数据统计与分析

采用DPS7.05软件处理急性毒性试验的7 d LC50、14 d LC50和回避试验48 h AC50；采用SPSS 19.0软件对抗氧化酶活性毒性试验数据进行方差分析，对处理组和对照组进行One-way ANOVA检验差异性分析。

2 结果（Results）

2.1 蚯蚓急性毒性试验

单一及联合急性毒性的LC50分别如表1和表2所示。2种农药对蚯蚓的急性毒性随暴露浓度增大和暴露时间延长，死亡率呈上升态势。14 d实验结果表明，当土壤中三唑磷浓度大于506.45 mg·kg-1时，蚯蚓死亡率达到100%，土壤农药浓度63.30、126.61、253.22 mg·kg-1对应死亡率分别为15%、50%、90%。死亡蚯蚓于烧杯内壁，发生糜烂降解；未死亡蚯蚓，体重下降，体长变短，呈卷曲、僵硬、消瘦症状，身体表皮有黄色贴液体渗出，对外界刺激敏感度很低(图1-a)；当土壤中氯氟氰菊酯浓度大于1 439.80 mg·kg-1时，蚯蚓死亡率达到100%，土壤农药浓度359.95、719.90 mg·kg-1各自的死亡率分别为20%和40%。未死亡蚯蚓呈体重下降、变细长症状(图1-b)，对外界刺激敏感度相对较高。三唑磷和氯氟氰菊酯按毒性比1:1复配增大农药对蚯蚓的急性毒性，其中三唑磷7 d和14 d的半致死浓度由单剂的331.10和122.00 mg·kg-1下降为23.17和5.94 mg·kg-1,毒性增大14.3和20.5倍；氯氟氰菊酯的LC50由单剂的897.90和656.70 mg·kg-1下降为138.15和35.41 mg ·kg-1，毒性增大6.5和18.5倍。7 d和14 d相加指数AI分别为3.55和9.00(>0.25为协同作用)，判定三唑磷和氯氟氰菊酯的联合作用方式为协同作用。

2.2 蚯蚓回避行为试验

图1 蚯蚓受三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）暴露后的形态

表1 三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓急性毒性效应Table 1 The acute toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm

表2 三唑磷和氯氟氰菊酯蚯蚓的联合毒性效应Table 2 The combined acute toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm

三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的回避行为结果如图2。随着各个处理药液浓度的增大，蚯蚓回避率都显著增大，其中混配三唑磷和混配氯氟氰菊酯处理浓度达到79.06和12.24 mg·kg-1时，回避率达到100%。从表3得知，三唑磷和氯氟氰菊酯48 h的半数回避浓度AC50分别是41.60和6.02 mg·kg-1；混剂-三唑磷和混剂-氯氟氰菊酯的AC50分别是7.16和1.13 mg·kg-1。联合作用致使回避毒性分别增大了5.8倍和5.3倍。相加指数AI为1.78，表明三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓具有协同回避毒性效应。

图2 三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的回避毒性效应

2.3 三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓抗氧化酶活性影响

2.3.1 三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓CAT酶活性影响

三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的CAT酶活性影响如图3。图3-a为三唑磷对蚯蚓CAT酶活性影响，蚯蚓酶活性整体随时间延长而降低。其中第2天处理组酶活性有所上升，但无明显的浓度-效应关系；第7天处理组酶活性明显下降，11.16和44.63 mg· kg-1处理组蚯蚓酶活性显著下降(P<0.05)；第14天处理组蚯蚓(2.79，11.16和44.63 mg·kg-1)酶活性极显著下降(P<0.01)。图3-b为氯氟氰菊酯对蚯蚓CAT酶影响，蚯蚓酶活性整体随时间延长变化不大，其中第2天，处理组酶活性受诱导上升，第7天处理组酶活都(21.80，87.21和348.84 mg·kg-1)显著上升(P<0.05)。图3-c为联合暴露对蚯蚓CAT酶活性影响，酶活性总体随时间延长变化不大，第2天处理组(11.16+87.21)mg·kg-1和(44.63+348.84)mg·kg-1酶活性显著及极显著诱导上升，第7天该2个处理组酶活性则都极显著诱导上升。CAT酶活性影响试验表明：亚致死浓度暴露下，三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓体内CAT酶活性具有明显的影响作用，三唑磷抑制蚯蚓体内酶活性，氯氟氰菊酯起诱导作用。联合作用与单剂作用比较结果发现氯氟氰菊酯对三唑磷联合效应随时间(2-7-14 d)变化为：协同-拮抗-拮抗，三唑磷对氯氟氰菊酯联合效应随时间(2-7-14 d)变化为：协同-协同-协同。

2.3.2 三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓POD酶活性影响

图3 三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）单独及联合（c）作用下蚯蚓体内CAT酶活性变化

表3 三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的回避毒性效应Table 3 The avoidance toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm

三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓POD酶活性活性影响如图4。图4-a为三唑磷对蚯蚓POD酶活性的影响，不同实验时期对照组和处理组蚯蚓酶活性并无明显差异。图4-b为氯氟氰菊酯对蚯蚓POD酶活性的影响，其中第2天处理组蚯蚓受药液影响，酶活性有所上升，第7天则轻微下降。图4-c为三唑磷和氯氟氰菊酯联合暴露对蚯蚓POD酶活性影响，随着暴露浓度上升，酶活性受到明显诱导，第2天的处理组(44.63+348.84)mg·kg-1和第7天的(11.16+ 87.21)mg·kg-1、(44.63+348.84)mg·kg-1酶活性都极显著诱导上升。POD酶活性影响试验表明：亚致死浓度暴露下，三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓体内POD酶影响不大，联合暴露显著诱导蚯蚓体内POD酶活性上升。

图4 三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）单独及联合（c）作用下蚯蚓体内POD酶活性变化

图5 三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）单独及联合（c）作用下蚯蚓体内SOD酶活性变化

2.3.3 三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓SOD酶活性影响三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓SOD酶活性影响如图5。图5-a为三唑磷对蚯蚓SOD酶活性影响，三唑磷抑制蚯蚓体内SOD酶活性。图5-b为氯氟氰菊酯对蚯蚓SOD酶活性影响，处理组氯氟氰菊酯浓度87.21和348.84 mg·kg-1显著诱导SOD酶活性上升。图5-c为联合暴露对蚯蚓SOD酶活性影响，第2天处理组酶活受到抑制，第7天处理组酶活性为负值，可能是由于农药对蚯蚓产生重度胁迫影响，导致体内SOD酶系统失去平衡。SOD酶活性影响试验表明：亚致死浓度暴露下，三唑磷抑制蚯蚓体内SOD酶活性，氯氟氰菊酯诱导SOD酶活性，联合暴露导致的蚯蚓体内SOD酶系统失调紊乱。

3 讨论（Discussion）

本研究通过致死和亚致死两方面探讨三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的单一及联合毒性效应。急性毒性效应实验(表1)中蚯蚓死亡率与三唑磷和氯氟氰菊酯暴露浓度呈现良好的线性关系，死亡率适合作为两者土壤残留量的定量表征。三唑磷和氯氟氰菊酯协同作用的实验结果与某些类似的研究结果有异同之处，赵玉琴等[22]发现氰戊菊酯和辛硫磷混配在24 h和48 h对鲢鱼的毒性效应为协同作用，在72 h和96 h却表现为拮抗作用，而其他的有机磷及氯氟氰菊酯都为拮抗作用，农药间的联合效应方式与多方面有关：1)农药的种类，不同种类农药的结构不同，对生物显示不同的作用机理；2)生物种类，不同生物对外源性毒物代谢方式表现有差异；3)作用时间，复配农药在体内在不同时间段具有不同的联合效应，一方面是因为农药在体内代谢先后顺序有关，不同时间段农药在体内的残留量不同，导致联合作用方式也不同；另一方面是因为不同时间段生物对外源性毒物的抗毒能力有差别；4)复配浓度，复配浓度影响作用强度和进入机体的速度。本文按1:1的等毒性当量复配证明2种农药具有协同作用，但是不能肯定其他配比是否相似结果，当配比差足够大的情况下，可能就表现为相加作用了。

回避实验是利用生物体趋利避害行为作为实验原理。通过实验发现，只有达到一定的暴露浓度才会产生比较明显的回避行为。一方面跟农药本身的气味性和挥发程度有关，另一方面与蚯蚓个体对农药气味的承受力有关，因此导致回避率与暴露浓度间未呈良好的线性关系。回避实验表明三唑磷和氯氟氰菊酯具有协同作用。

抗氧化酶(CAT、POD、SOD)常作为环境污染检测的分子生物标志物，众所周知不同类型的农药混合可以促进农药对生物体内氧化系统应激的刺激效应[23]。正常生理条件下生物体内活性氧与抗氧化酶防御系统处于动态平衡，当抗氧化防御系统不能消除机体产生的活性氧时，则导致氧化应激。从蚯蚓抗氧化酶(CAT、POD、SOD)对三唑磷和氯氟氰菊酯的动态响应试验中可以发现(图3，图4，图5)，不同类型抗氧化酶对不同农药的氧化胁迫具有不同的响应方式。CAT酶在抗氧化机制中发挥着关键的作用，它将过氧化氢(H2O2)转化为氧气(O2)和水(H2O)[10]。CAT酶随着三唑磷浓度的升高，酶受到抑制活力下降，随着氯氟氰菊酯浓度升高，酶受到诱导活力上升；蚯蚓受外来干扰物刺激，产生超出正常范围内的过氧化氢，CAT为了维持动态平衡，酶活性增强，消除过量的H2O2，但随着时间的延长，H2O2的不断积累，导致CAT酶受到抑制下降。有研究表明蚯蚓经过受甲基嘧啶磷和溴氰菊酯单独污染的土壤暴露后，体内的CAT酶在第1天酶活性受诱导上升，在3、6、10、15、21、28 d都受到抑制[24]，这与本文研究结果具有相似之处。过氧化物酶POD一般被认为是与过氧化氢酶CAT具有相似的存在意义，本文研究发现该酶活性对三唑磷和氯氟氰菊酯未表现出明显的响应反应,这可能与受试农药的浓度有关，因为不同的酶的氧化应激平衡受外来胁迫的能力不同；超氧化物歧化酶SOD是消除氧自由基，合成过氧化物的金属酶，研究结果发现对三唑磷和氯氟氰菊酯的响应类型与CAT酶类似，酶活力受三唑磷抑制下降，而受氯氟氰菊酯诱导上升，但SOD酶更加敏感。这些结果与某些学者研究具有类似之处[3]。因为酶具有不稳定性和生物代谢复杂性，所以很难确定具体的联合作用效应，有待结合基因表达进行深入探讨研究。

农药联合作用效应的产生是由于2种或2种以上药物间在物理化学、生理生化、药效(或生物活性)等方面的相互影响，包括穿透和运输、代谢过程、贮存过程、对靶标的联合作用。三唑磷和氯氟氰菊酯有共同的作用靶标器官(神经)但作用机理不同。三唑磷通过抑制脑突触体膜上的腺苷三磷酸酶(ATPase)，使突触膜上的乙酰胆碱酯酶等神经递质大量聚集，从而引起乙酰胆碱酯酶被抑制，造成靶标生物过度兴奋而死[25]。氯氟氰菊酯主要作用靶标是神经细胞膜上钠离子通道，干扰钠离子通道的门控动力学，在膜去极化期间减缓失活，延长钠离子电流，引起重复后放和神经传导的阻断[26]。有研究表明有机磷杀虫剂与拟除虫菊酯对桃蚜和棉蚜有协同作用，主要机制在于前者能抑制羧酸酯酶的活性，而羧酸酯酶能够水解拟除虫菊酯[27]。本文认为，三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的协同作用与其阻断神经传导这一共同靶标有关。

本文从急性毒性、回避行为、抗氧化酶活性三方面探讨农药联合作用对生态的风险影响，只是针污染物对受试生物个体水平表观影响，但生态环境健康与群体关联更紧密，因此后续工作将研究农药对蚯蚓的繁殖毒性影响。蚯蚓常作为土壤生态污染的指示生物，但是评价污染物对生态的影响不能只局限于一种生物，通过选取水生生物(如斑马鱼、大型溞，藻类等)进行药效研究可能会更全面的反应农药的联合作用效应。

综上所述，结果表明：(1)三唑磷和氯氟氰菊酯按等毒比复配对蚯蚓具有协同作用，彼此增大毒性。(2)蚯蚓的死亡率与农药浓度呈现良好的剂量-效应关系，适合作为两者土壤残留量的定量表征终点，回避率与浓度没有良好的线性关系，不适合作为定量表征终点。(3)三唑磷和氯氟氰菊酯复配可能增大生态危害风险，农业生产过程中应合理使用。

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The Single and Joint Toxicity of Tiazophos and Cyhalothrin to Earthworm

Su Lianshui1,2,Yang Guiling2,Wu Shenggan2,Pi Tianxing2,Wang Qiang2,*

1.College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China
2.Institite of Quality Standards for Agro-products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China

9 December 2015 accepted 26 January 2016

The usage of pesticide mixture has been a common method for agriculture which may have many differences with the single use of pesticide.The joint toxicity effect of tiazophos and cyhalothrin to earthworm were studied using OECD artificial soil method.Acute toxicity,adviodance behavior and antioxidant enzyme activities (CAT,POD,SOD)were observed.The result indicated that 7 d-LC50and 14 d-LC50of tiazophos are 331.1 mg· kg-1and 122.0 mg·kg-1in acute toxicity test;7 d-LC50and 14 d-LC50of cyhalothrin are 897.9 mg·kg-1and 656.7 mg·kg-1.The mixture with the ratio of 1:1 of toxic unit showed synergistic effect.The medium concentration for avoidance behavior(AC50)of tiazophos is 41.6 mg·kg-1and of cyhalothrin is 6.0 mg·kg-1in adviodance behavior experiment.The mixture showed synergistic effect.Enzyme activities test indicated that CAT activity rose after decreased whenEisenia foetidawas exposed to two pesticide singly.The POD activity increased in the joint expo-sure.The CAT and SOD activities decreased in the joint exposure.It is concluded that joint exposure can strengthen toxicity toE.foetida.Joint toxicity effect of tiazophos and cyhalothrin is related to blocking the nerve transduction.

tiazophos;cyhalothrin;Eisenia foetida;acute toxicity;autioxidant enzyme activities

2015-12-09 录用日期：2016-01-26

1673-5897（2016）3-294-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151209001

简介：王强(1963-)，男，博士，研究员，主要研究方向为农药毒理与应用。

浙江省重大招标项目(2014C02002)

苏连水(1990-)，男，硕士研究生，研究方向为生态毒理学，E-mail:13340116335@163.com

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:wq13575733860@126.com