NMR代谢组学在水生软体动物生态毒理研究中的应用

毛小华，陆开宏，杨文，朱津永

宁波大学海洋学院教育部应用海洋生物重点实验室，宁波315211

NMR代谢组学在水生软体动物生态毒理研究中的应用

毛小华，陆开宏，杨文，朱津永*

宁波大学海洋学院教育部应用海洋生物重点实验室，宁波315211

随着核磁共振(NMR)技术的不断发展，基于NMR的代谢组学方法已经逐渐成为研究水生动物在代谢水平响应环境变化的一种有效方法。水生软体动物作为重要的环境监测生物，近年来人们在其相关研究中取得了不小的成果。文章总结了利用NMR的代谢组学方法研究各类环境胁迫因子对水生软体动物代谢影响的成果，主要综述了水生软体动物不同组织内代谢物组成和含量对环境胁迫的响应，同时对水生软体动物生态毒理代谢组学研究中存在的问题和今后的发展方向进行了讨论和展望。

核磁共振；水生软体动物；生态毒理；代谢组学

毛小华,陆开宏,杨文,等.NMR代谢组学在水生软体动物生态毒理研究中的应用[J].生态毒理学报,2016,11(3):36-46

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随着人类活动的加剧，全球的大部分水体均受到不同程度的各类污染(如重金属、农药和工业化学物质污染等)，这些环境污染物直接或间接的导致了水生生物各类不良反应，甚至死亡[1]。生活于水环境中的各类水生软体动物由于其较弱的活动能力(运动缓慢或是营固着生活)更是直接暴露于污染物中，然而由于这些物种具有分布广泛，个体大小适中，收集方便，种群数量大，并且对污染物具有极强的耐受性等特点，逐渐受到生态学家们的重视[2]，并作为生物监测物种用于评估环境污染[3]。然而软体动物是如何抵御这些有毒物质的不良影响的？其背后的作用机制是怎样的？对于这些问题，现有的研究结果仍无法给出令人信服的解释。虽然利用酶学和蛋白组学等手段使人们了解了一部分软体动物强大解毒能力的背后机制[4]，但是随着研究的深入和发展，人们发现除了大分子蛋白质在软体动物应对环境胁迫时发挥着重要功能外，内源性小分子代谢产物也在响应环境变化过程中起着重要作用[5]。由于这些小分子代谢产物的变化常常不反映在基因转录和蛋白表达水平，而是反映在物质的代谢改变上,且因其种类繁多，对单一成分的分析测定难以窥探对全局代谢的影响，这就需要借助代谢组学方法来系统研究这些物质的整体变化规律。

1 基于NMR的代谢组学技术简介

代谢组学(metabolomics)最早起源于20世纪70年代的代谢轮廓分析，随着基因组学的提出和迅速发展，Nicholson等[6]在1985年利用核磁共振技术(NMR)分析大鼠的尿液，并于1999年提出了代谢组学的概念。目前最常用的代谢组学分析手段包括液相色谱-质谱联用(LC-MS,liquid chromatography-mass spectrometry)、气相色谱-质谱联用(GC-MS,gas chromatography-mass spectrometry)、高效液相色谱(HPLC,liquid chromatography)以及核磁共振(NMR,nuclear magnetic resonance)，而基于NMR的代谢组学方法是新发展起来的一门新技术，其重复性好，可无偏向性的检测到代谢物，能够快速地确定代谢物的结构和定量信息[7-8]。此外还具有样品前处理简便，仅需少量样品即可完成测定，且不会破坏样品的结构和性质的特点[9]。而传统的研究只能同时监测最多数种代谢物的动态[10]。基于NMR的代谢组学研究可以同时分析从生物样品中成百上千的内源性代谢物[11]，对样品进行系统的代谢轮廓描述。目前，NMR代谢组学分析技术已广泛应用于多个领域，包括药物毒性检测[12]、先天性疾病诊断[8]、功能基因组学[13]和环境毒理学[14]等。

2 基于NMR代谢组学方法研究水生软体动物对各类环境胁迫的代谢响应

自2001年Nicholson发表了第一篇论文以来，应用NMR代谢组学方法研究动物生态毒理的论文数量呈逐年增加的趋势(图1)，尤其是进入2005年后，其增长速度更加明显，不仅反映出国内外对基于NMR的代谢组学方法研究投入的不断增加，也反映出对水生生态系统的关注，然而对于软体动物的相关研究相对缺乏且主要集中在海水种类上。已有研究中，软体动物体内作为代谢解毒中心的肝胰脏和作为人类主要食用部分的肌肉组织成为关注的重点，此外鳃、性腺及外套膜等也常常作为研究对象。研究中涉及到的主要环境胁迫因子包括：生物胁迫(如病原感染)、重金属胁迫、化学物胁迫(如杀虫剂和激素类物质)和物理胁迫(温度、溶氧和盐度变化)以及石油污染物胁迫等。软体动物组织内代谢物组成和含量变化主要表现在氨基酸、能量物质(如葡萄糖)和渗透压调节物(如龙虾肌碱和甜菜碱)等代谢物上(表1)。

图1 应用NMR代谢组学方法研究动物生态毒理的论文数统计

续表

续表1

2.1 温度

软体动物作为变温动物，温度是影响其代谢水平的的主要因素之一[15]。虽然水生软体动物能够适应较广的温度范围，但超出其最适温度范围必然导致机体内代谢的一系列变化[16-17]。研究显示，温度的升高和下降都会影响水生软体动物的代谢，但是温度的升高相对于温度的下降对水生软体动物的影响更为显著[5]。因此，现有研究主要集中于对水生软体动物的热应激的反应上，而对冷应激的相关报道较少。

由于病原微生物的感染，水生软体动物容易患上干枯综合症(Withering syndrome)[18]。Rosenblum等[5]利用NMR代谢组学方法观察不同温度(13.4℃和17.3℃)对红鲍螺(Haliotis rufescens)的代谢影响后，证实了温度的升高使红鲍螺更易感染这种疾病，同时还发现温度的升高与2种热休克蛋白(hsp72和hsp89)的含量水平呈正相关，而与能量代谢产物(如磷酸肌酸、ATP和糖原)的含量水平呈负相关。

2.2 盐度

低盐度可以诱导海洋软体动物体内的渗透压降低，但是一些海洋软体动物可以通过保持细胞内高浓度的游离氨基酸来维持细胞内外渗透平衡[18-19]。研究发现，在盐度下降时，菲律宾蛤(Ruditapes philippinarum)鳃组织的氨基酸含量变化表现为除丙氨酸和组氨酸外，多种氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸等)含量显著增加。此外，在盐度下降的胁迫下，菲律宾蛤消化腺的氨基酸含量变化与鳃组织中所观察到的现象类似，主要差异在于其甘氨酸含量的增加表现的更为明显[20]。研究人员还发现在盐度变化的胁迫下，菲律宾蛤消化腺的3种渗透压调节物(牛磺酸、甜菜碱和龙虾肌碱)含量显著降低，磷酸胆碱含量显著上升。这似乎说明，盐度的下降会干扰菲律宾蛤消化腺的渗透调节系统，而磷酸胆碱含量的上升是由于胆碱和ATP通过胆碱激酶的催化形成磷酸胆碱和ADP，并释放能量，因此磷酸胆碱含量的上升也暗示了盐度的胁迫会干扰菲律宾蛤的能量代谢过程。

2.3 重金属

一系列关于重金属对水生软体动物的代谢影响研究发现，虽然不同的水生软体动物对不同重金属的代谢响应存在差异，但由重金属诱导的代谢都表现出相似的变化[21-28]。Liu等[23]用基于NMR的代谢组学方法来研究3种不同家系的菲律宾蛤(白色蛤仔、红色蛤仔和斑纹蛤仔)在汞的胁迫下其肌肉代谢物的变化。结果发现与其他2种蛤仔相比，白色蛤仔的代谢物富含高水平的支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、甜菜碱、葡萄糖和糖原。这似乎说明，在汞的干扰下，白色蛤仔在渗透调节和能量代谢方面表现得更敏感。Wu等[29]通过NMR代谢组学方法研究铜和镉暴露对翡翠贻贝(Perna viridis)产生的代谢影响。结果发现铜和镉同时暴露与单独铜暴露有着相似的代谢指纹谱，都会引起氨基酸、能量代谢物和渗透压调节物含量的改变，同时还会引起谷氨酸盐含量的过度积累，毒害翡翠贻贝的神经系统，导致其神经细胞的死亡。Liu等[21-22]也利用基于NMR的代谢组学方法观察了菲律宾蛤不同组织(消化腺和鳃)对汞胁迫的响应，结果发现与鳃组织相比，其消化腺的代谢物含量变化更为显著，主要包括氨基酸代谢的变化，如支链氨基酸的增加、能量代谢的变化、神经毒素的产生和渗透压调节的改变。这一系列的研究结果均说明基于NMR的代谢组学方法可以有效地分析重金属对水生软体动物的代谢影响情况。

2.4 食物变化

许多水生软体动物可以通过调节自身的代谢水平来适应食物的缺乏[30]。Rosenblum等[5]通过NMR代谢组学方法研究食物缺乏对红鲍螺足部肌肉的代谢影响，结果发现肉碱、甘氨酸和龙虾肌碱的含量大幅度下降。由于肉碱参与脂质的氧化代谢[31]，因此其含量的减少反映出红鲍螺正在通过脂质氧化产生能量以抵御食物的缺乏，而甘氨酸和龙虾肌碱含量的减少也证实了食物的缺乏会干扰红鲍螺的渗透压调节系统。Tuffnail等[32]利用NMR代谢组学方法观察食物缺少对紫贻贝(Mytilus edulis)足部肌肉组织的代谢变化影响，实验结果证实了食物的缺少对紫贻贝代谢的影响主要包括渗透调节的改变、氨基酸代谢的变化和能量代谢物的改变。尤其是与能量代谢相关的葡萄糖、延胡索酸盐和ATP的含量大幅度升高，这可能表明在紫贻贝的肌肉组织中与能量代谢相关的代谢产物被大量消耗掉，因此需要合成更多的葡萄糖、延胡索酸酯和ATP以维持紫贻贝的能量代谢。

2.5 病原感染

Liu等[33]利用基于NMR的代谢组学方法比较了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和灿烂弧菌(Vibrio splendidus)对菲律宾蛤的代谢影响，结果发现这2种病原体都会干扰菲律宾蛤的能量代谢、氨基酸代谢和渗透调节过程，但是在鳗弧菌的干扰下，菲律宾蛤的代谢产物变化更敏感。尤其是支链氨基酸、葡萄糖、甜菜碱和牛磺酸的含量显著上升。由于支链氨基酸是一类参与特殊供能的氨基酸，能以相当快的速度转氨和完全氧化，其氧化产生ATP的效率高于其他氨基酸，因此葡萄糖含量的上升，证实了支链氨基酸具有促进糖异生的作用。而甜菜碱和牛磺酸含量的升高，说明与灿烂弧菌相比，鳗弧菌对菲律宾蛤的渗透调节系统干扰更显著。同时，Ji等[34]利用NMR代谢组学方法观察鳗弧菌对紫贻贝鳃组织的代谢影响，结果在检测到的代谢产物中，支链氨基酸、储能化合物葡萄糖、三羧酸循环的中间产物琥珀酸的含量显著上升，天冬氨酸、甜菜碱的含量显著降低。并且这些代谢产物含量的变化类似于感染了藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的贻贝，尤其是支链氨基酸的变化，表明不同病菌可以在贻贝鳃组织中诱发类似的生物效应。葡萄糖含量的上升表明紫贻贝需要消耗更多的能量来解决紫贻贝强烈的能量代谢变化。另外，由于在软体动物的一些代谢途径中，在无氧条件下其细胞内的天冬氨酸可以转换成琥珀酸，因此天冬氨酸的减少和琥珀酸的增加意味着被鳗弧菌感染的紫贻贝逐渐从有氧呼吸走向了厌氧呼吸[35]。

2.6 化学物污染

Hines等[36-37]利用NMR代谢组学方法探究有毒化学物林丹(lindane)和阿特拉兹(atrazine)对紫贻贝代谢的影响，结果发现，虽然紫贻贝对这2种化学污染物的代谢响应存在差异，但也表现出了一些共性，如出现了氨基酸、龙虾肌碱、氧化三甲胺(TMAO)含量的上升。氧化三甲胺和龙虾肌碱是水生软体动物体内维持渗透压平衡的重要物质[38]，并且当氧化三甲胺和龙虾肌碱不足以维持水生软体动物渗透平衡时，海洋软体动物会依靠自由氨基酸的浓度来维持细胞内的渗透平衡，而淡水软体动物主要依靠脂肪酸和酮体来维持细胞内的渗透平衡[18]。此外，Tikunov等[39]通过NMR代谢组学方法观察牡蛎(Ostrea gigasThunberg)在高氯酸胁迫下其代谢产物的变化，结果发现甜菜碱的浓度改变程度最高，而甜菜碱与维持细胞渗透平衡有关，说明高氯酸可能最先破坏牡蛎的渗透调节系统。研究人员还发现，牡蛎消化腺中的糖原含量上升，暗示了消化腺才是牡蛎最有可能储藏葡萄糖的场所。

近年来，国内外许多研究者开始关注农药污染对水生软体动物的代谢影响[40-42]。目前的研究显示，基于NMR的代谢组学方法为研究化学污染物对水生软体动物机体代谢活动的影响提供了一个强大的方法。但值得注意的是，水生软体动物暴露于不同化学污染物时其代谢特征是不同的[43]。并且现阶段的研究多注重室内暴露与效应的关系，尚未很好地同野外实际相结合，因此，应用代谢组学方法对化学物污染的毒理机制探究有待于进一步加深。

3 应用NMR代谢组学方法研究水生软体动物的发展趋势

目前，代谢组学正处于快速发展阶段，日益成为研究的热点。随着研究的不断深入，代谢组学必将在水域生态领域中发挥更大的作用，并与多维核磁共振技术、高分辨率质谱技术、多维色谱质谱联用技术等的联合应用，将帮助我们更易从大量代谢产物中找出特异性代谢标志物。同时与代谢组学、转录组学、蛋白质组学和基因组学进行整合，互相验证，将是水生生物代谢组学方法发展的方向。

3.1 代谢组学与其他组学的联用

随着现代分析技术的发展，代谢组学开始与其他组学(基因组学、转录组学、蛋白组学)结合起来，现已成功地应用于生态毒理学上[44-45]。尤其是先通过蛋白组学技术和基因组学技术寻找相关蛋白质和相关基因的表达变化规律，再通过代谢组学方法分析代谢产物的变化规律，最后通过检测到的相应蛋白质、相应基因与代谢物的结合分析和相互验证，更深入地探讨生态毒理机制。

Wu等[20]结合了蛋白质组学和代谢组学方法研究了砷的毒性效应在不同海水盐度下对菲律宾蛤仔鳃组织的影响。研究表明，盐度能影响砷对菲律宾蛤仔的毒性效应。用代谢组学方法可以观察到相关的代谢标记物ATP、琥珀酸含量显著上升，利用蛋白组学技术可以观察到相关的蛋白标记物如ATP合酶、琥珀酰辅酶A和核苷二磷酸含量显著上升。而ATP合酶、琥珀酰辅酶A和核苷二磷酸的上升与代谢标记物ATP和琥珀酸的上升呈正相关。实验结果充分证明代谢组学和蛋白质组学的结合在研究生态毒物对水生软体动物的影响方面具有有效的互补性。因此，通过蛋白质组学和代谢组学的整合来研究环境污染物对水生软体动物的影响，能更有效地反映水生软体动物完整的生态毒理机制。

值得提出的是，在各种组学的研究中，基因组学和蛋白质组学是分别从细胞基因改变和蛋白表达修饰水平研究水生生物对外界干预的应答，而代谢组学是以生物体内源性代谢物的动态变化为对象来研究生命活动的[46]。虽然我们已将各种组学初步结合到了一起，但目前各个组学的整合是线性的，然而生物体是一个复杂的非线性的巨大系统，因此各个组学之间的结合有必要从目前的线性发展到非线性。同时还有一个突出的问题是蛋白组学更倾向于检测到含量较多的蛋白(如肌动蛋白、结构蛋白)，而那些参与代谢物合成和分解的相关蛋白(如酶类)，可能由于含量较低而很不容易检测到[47]，其次很多蛋白虽然能够表达出完整的序列，但是还需要进行修饰、加工和具有一定的空间结构才有真正的生物活性，所以即使是那些检测到的蛋白也不一定能参与代谢活动。这也是造成目前蛋白组学与代谢组学两者结果间缺乏完全同步性的原因。因此目前我们还只能通过代谢组学寻找特定的响应代谢物，再通过蛋白组学去找相关的特异性酶，监测这些酶的相关变化，从而达到减少实验工作量的目的。

3.2 NMR与其他检测技术的联用

目前没有一种分析方法可以单独检测到所有代谢物[48]。不同的分析技术有着不同的适用范围，NMR技术可以检测到小分子代谢物中的亲水组分，如葡萄糖、氨基酸、有机酸和核酸等，而疏水组分的检测主要通过质谱手段实现，其中GC/MS可用来检测胆固醇与饱和及不饱和脂肪酸，LC/MS则更适合油脂和磷脂的分析。为了尽可能的收集到更多代谢物的动态信息，研究者开始采用多种技术联用的方法。如Ong等[49]结合GC/MS、LC/MS和NMR研究斑马鱼(Barchydanio rerio)肝脏的生化轮廓。结果可以明显检测到斑马鱼肝脏的氨基酸、不饱和脂肪酸、胆固醇、磷脂和其他小分子等多种生化成分的变化，从他们的整体的研究结果表明，多平台的方法能够提供一个更全面的的代谢分析轮廓，因此，借助多种分析技术联用的方法来探讨水生软体动物的代谢机制或许将是未来研究的新趋势。

3.3 寻找生物标志物

在水生软体动物的研究上，代谢组学在寻找毒物生物标志物方面具有巨大的潜力。代谢组学主要集中在研究其肌肉、肝脏组织等毒性生物标志物上[50]，比较这些研究可以发现，不考虑毒物的性质、作用机制和作用靶组织，在毒物的干预下，水生软体动物的代谢产物(柠檬酸盐、葡萄糖和磷酸肌酸等)通常都会出现一系列变化，需要强调的是，不是所有的这些代谢产物在任一种毒物的干预下都会出现变化，不同毒物干预所引起的这些代谢产物变化的途径也不都相同。而且毒理学研究最重要目的是阐明毒理机制，与没有明确机制的生物标志物相比，明确机制的生物标志物具有更大的优势。通过代谢组学获得的生物标志物可以作为敏感的生物效应“早期预警”工具，在环境质量评估中具有非常重要的意义。

3.4 代谢流组学（fluxomics）的产生

为进一步了解生物体的代谢途径，近年来，出现了代谢流组学(fluxomics)，它是研究细胞内分子随时间的动态变化规律的一个新兴的组学，能够通过跟踪稳定同位素在代谢网络中的转移并进行相应的模型计算，有效地定量代谢流量及其变化，可以对环境扰动的影响给予充分的评价，并能对特定途径和反应的重要性进行准确的描述，是对代谢组学的一个有益补充。目前国内外对代谢流组学的研究仍处于起步阶段。在水生软体动物中的研究仅有Tikunov等[51]利用NMR通过13C同位素标记实现了对美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的代谢途径分析，证实了美洲牡蛎的消化腺和肌肉组织的葡萄糖主要是通过糖酵解这一厌氧途径消耗掉，且牡蛎糖酵解的最终产物是丙氨酸而非乳酸。

4 问题与展望

毫无疑问，代谢组学相对于其他组学能更快、更准确地发现毒性物质和毒性规律。尤其是在水生生物应答逆境胁迫研究领域中，其应用确实取得了一些新进展，拓展了对于水生生物耐受逆境胁迫分子机理的认识，然而对于水生生物复杂的应答胁迫代谢的机制来说，代谢组学其目的是分析随着环境的改变其代谢物含量的变化，主要体现在表型的变化上。因此，代谢组学如何更广泛地应用在水生态毒理上，还需要通过转录组学、蛋白质组学和基因组学的整合，使每种组学都能最大的发挥出各自的优势，以达到概述生物在不同的时间尺度上，其从基因型到表型的变化，帮助人们从整体水平上把握水生生物胁迫应答机制。其次，水生态环境是易变的，通常生物接触的毒物是复杂的混合物，而不是单一的物质，所以难以识别单个化合物的影响能力，因此代谢组学对探究环境污染的毒理机制上有待于进一步努力，目前我们的认识仍然十分有限，仅有不多的实验室从事于水生生物环境代谢组学研究，所获得的成果自然也不明显。但值得一提的是，虽然我们现在还不知道代谢组学会在多大的程度上影响水生生态毒理学的研究，但它的确是为评估水生生物的代谢状态提供了一种具有潜力的快速的方法。因此，开展更多水生生物的应答胁迫的相关代谢组学研究，无疑能促进人们对于水生生物胁迫应答代谢规律的系统认知，帮助人们从整体水平上把握水生生物胁迫应答机制，最终推动水生生态毒理学的发展。

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Application of NMR-based Metabolomics in the Study of Ecotoxicology of Molluscs：A Review

Mao Xiaohua,Lu Kaihong,Yang Wen,Zhu Jinyong*

Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,School of Marine Sciences,Ningbo University,Ningbo 315211,China

1 July 2015 accepted 17 September 2015

With the development of the nuclear magnetic resonance(NMR)technology,NMR-based metabolomics has gradually become an effective approach for studying the metabolic response of aquatic animals to environmental change.As the sensitive species,aquatic molluscs are the important organisms in environmental monitoring,and significant progresses have been made.This paper reviewed the research progresses on the metabolic aspects of various environmental contaminants or stressors in aquatic molluscs based on NMR metabolomics technology,and mainly fouced on the metabolic differences among the various tissues in terms of metabolites and their concentration levels.The shortcomes of recent research and prospective future work on NMR-based metabolomics in aquatic ecotoxicology are also discussed.

nuclear magnetic resonance;aquatic molluscs;ecotoxicology;metabolomics

2015-07-01 录用日期：2015-09-17

1673-5897（2016）3-036-11

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150701003

简介：朱津永(1983—)，男，博士，讲师，主要研究方向水域生态与环境，发表学术论文20余篇。

国家自然科学基金项目(31302192)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(20123305110001)；国家星火计划项目(2014GA701024)；浙江省教育厅科研项目(Y201327177)

毛小华(1990-)，女，硕士研究生，研究方向为水生软体动物代谢组学，E-mail:236040341@qq.com

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:zhujinyong@nbu.edu.cn