大型蚤对五价砷抗性选择的响应

李莉霞，李丹，高蜜，穆磊，陈红星，谢凌天

中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室，沈阳110016

大型蚤对五价砷抗性选择的响应

李莉霞，李丹，高蜜，穆磊，陈红星，谢凌天*

中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室，沈阳110016

金属污染对栖息在该环境中的生物具有强大的选择力，生物若能进化出对该金属的抗性则能在该环境中生存下去，否则将会灭绝。人工模拟的选择方法可以用来研究生物对金属的抗性进化。为了探索大型蚤(Daphnia magna)是否能进化出对五价砷(As(V))的抗性，采用多代选择的方法对其进行了As(V)诱导的抗性响应研究。依据本实验室大型蚤对As(V)的96 h半致死浓度(4.25 mg·L-1)，试验选取As(V)亚致死浓度(8.0 mg·L-1)对大型蚤进行选择，每代选择30%～50%对As(V)耐受性高的大型蚤转移至不加As(V)环境下继续繁殖得到下一代，并重复该选择过程至获得第五代(F5)终止试验。以选择组F5代及对照组F5代大型蚤为测试目标，考察其在As(V)继续暴露下的存活时间以期获得具As(V)抗性大型蚤。结果显示，在F5代中，选择组大型蚤在As(V)(8.0 mg·L-1)暴露下的存活时间相比对照组显著延长175%，证实了大型蚤对As(V)的进化抗性。进一步研究发现，选择组F5代与对照组F5代相比繁殖力下降19.96%，平均每批产仔量降低15.71%。这表明经过五代人工选择后，大型蚤能够进化出对As(V)的抗性，而这种抗性的进化伴随以生物适应性参数的降低为代价。另外，大型蚤对这种抗性的获得机制(对As(V)的累积和脱毒机制)仍需进一步研究。

五价砷；大型蚤；抗性；多代选择；生物适应性

李莉霞,李丹,高蜜,等.大型蚤对五价砷抗性选择的响应[J].生态毒理学报,2016,11(3):237-242

Li L X,Li D,Gao M,et al.Rapid evolution of resistance to As(V)inDaphnia magna[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):237-242(in Chinese)

自然选择是指生物在生存斗争中适者生存、不适者被淘汰的现象，是生物本身与自然环境相互作用的结果。在自然条件下，环境中的污染物对生物来讲，也属于一种自然选择的力量。一般来说，对于生物个体而言，其对某一污染物的抗性在生物群体中呈正态分布的趋势，对污染物抗性大的个体要比耐受性弱的个体存活的机率大。从群体遗传学角度来讲，这些抗性大的个体在污染的环境中若继续繁殖，其下一代群体的平均抗性会增加。经过多代选择以后，新的子代群体相对于亲代群体而言，对该污染物应该具备了一定的抗性。以往生物体对污染物抗性的进化及其代价的报道，常见于对杀虫剂具抗性的昆虫和矿区耐金属的植物两方面的研究[1-2]。然而，动物对金属的抗性进化则鲜有报道[3]。Klerks和Levinton[4-5]的研究发现，一种淡水寡毛纲生物霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)可以在Cd和Ni重度污染的河流中生存。进一步研究发现，这种生物已经进化出对Cd的抗性，且这种抗性具有可遗传性。Xie和Klerks[6-7]对一种小型淡水鳉鱼(Heterandria formosa)进行六代人工选择后，也使其成功获得了对Cd的抗性，但这种抗性伴随有生物适应性代价，表现在总繁殖力下降、每批产仔量下降、繁殖第一批时间延长、雌鱼寿命缩短等方面。

砷(arsenic,As)是一种有毒的类金属元素，属持久性污染物。随着我国经济及城镇化的快速发展，特别是矿物的开采和有色金属的冶炼，含砷污染物的排放量也越来越大。这些污染物若进入水体，会对水体生态系统造成不同程度的危害影响。据目前的报道，砷在自然水体系统中的含量范围约为0.5 μg·L-1～5 mg·L-1，在开放海域中的平均值为1.5 μg ·L-1，在污染河流的平均值为0.8 μg·L-1，而在污染严重的地区则可达到20 mg·L-1[8-9]。砷在淡水水体中主要以无机砷(iAs)的形态存在，主要包括五价As (V)和三价As(III)2种价态。砷的浓度、形态及价态等因素，共同决定了其对生物体的毒性大小[8]。对水生生物而言，若长期暴露于砷污染的胁迫环境之中，经过多代遗传进化的选择，成功存活下来的种群理论上应具备对砷的抗性。

大型蚤(D.magna)是一种常见的实验室模式生物，具有个体小、繁殖快、产仔量多、易培养等优势，且对毒物较为敏感，常被用于生态毒理学研究中。早期对大型蚤的研究多集中在生长发育及繁殖等方面，比如对工业废渣废水、重金属、有机农药等化学品的毒性检测报道[10-12]。随着毒理学技术的发展，污染物在大型蚤累积及代谢方面的研究也得到了开展[13-14]。在长期毒性研究方面，Ward和Robinson[15]进行了大型蚤对镉(cadmium,Cd)的八代抗性筛选试验，Dietrich等[16]用4种不同化学药品氨甲酰氮草(carbamazepine,CBZ)、双氯高灭酸(diclofenac,DIC)、乙炔雌二醇(17α-ethinylestradiol,EE2)、美托洛尔(metoprolol,MET)对大型蚤进行了六代慢性毒性研究，杨晓凡等[17]进行了环境相关浓度下的磺胺甲恶唑、氧氟沙星和布洛芬对大型蚤的六代慢性毒性研究。然而，有关水生生物对污染物的长期慢性的毒理数据仍然相对缺乏，而有关砷抗性及砷对淡水生物的毒理学研究更是少见报道。

本研究选取大型蚤为试验生物，以亚致死浓度(8.0 mg·L-1)的As(V)对其进行暴露，并连续选择至第五代(F5)。在F5代大型蚤中，分析选择组与对照组在砷(8.0 mg·L-1)胁迫下的存活时间，并比较2种处理组在不加砷环境下的生物适应性参数，从而探讨人工模拟自然环境条件下的大型蚤对砷抗性的进化及生物适应性代价的过程。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 试验材料

大型蚤(Daphnia magnaStraus)由中国科学院生态环境研究中心赠与，并于本实验室培养。大型蚤试验用水为依据USEPA(2002)标准配制的硬水(hard water)[18]。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)购于中国科学院水生生物研究所，并于SE培养液中接种扩增。试验于光照培养箱中进行，设置温度(24±1)℃，光周期14 h(光照):10 h(黑暗)。

十二水砷酸钠(Na3AsO4·12H2O)为分析纯试剂。试验所需溶液均由超纯水(DI water,18.2 MΩ)配制，所需容器均在试验前于5%硝酸溶液中浸泡过夜，并由超纯水冲洗至少4遍后使用。

1.2 急性毒性试验

为得到本实验室大型蚤对As(V)的96-h LC50(96 h半致死浓度)，试验设置6组不同的浓度梯度：0、20、30、40、50、60 mg·L-1的十二水砷酸钠(即0、3.54、5.31、7.07、8.84、10.61 mg·L-1As(V))。每组梯度各含3个平行，每个平行用500 mL塑料烧杯装有300 mL硬水，并随机转入10只新生大型蚤幼蚤(<24 h)。暴露期间不换水，不喂食。每隔12 h记录1次死亡数目。

1.3 多代抗性选择试验

在1.2试验的基础上，试验共设置2种处理：选择组(S,selected group)和对照组(C,control group)，其中选择组的暴露溶液中As(V)浓度为8.0 mg·L-1，含5个平行(即S1～S5)，并以不添加砷的硬水为对照组，含3个平行(即C1～C3)。每个平行均用500 mL塑料烧杯装有300 mL相应溶液，并随机转入20～30只新生大型蚤(<24 h)(亲代P，parental generation)。当选择组每杯平行中的大型蚤死亡率约30%～40%时(约暴露48 h)，将存活大型蚤转至干净不加砷的硬水中培养，喂食少量蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)，待大型蚤稳定后，存活率约为30%～50%。待大型蚤繁殖，所产幼蚤即为子一代(F1 generation)。将F1代大型蚤(<24 h)继续转移至另一个事先准备的装有8.0 mg·L-1的As(V)溶液的容器中继续暴露，重复上述选择过程并培养获得子二代(F2 generation)大型蚤。以此类推，直至获得子五代(F5 generation)后终止试验。对照组大型蚤置于干净不加砷的硬水中培养，喂食少量蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)，并与处理组同步培养到第五代。在整个培养过程中，每3 d换1次硬水。而人工选择试验的抗性是否成功获得，是仅以两处理组的F5代大型蚤进行砷抗性的对比。

1.3.1 F5代存活时间分析

随机从2个处理组S1～S5，C1～C3的每杯平行中分别取出10～20只F5代幼蚤(<24 h)，并每2只1杯转入50 mL小烧杯中，每杯含30 mL的8.0 mg· L-1As(V)溶液。每隔3 h记录1次死亡现象(凌晨00:00～6:00不观察，若此时间段内有死亡现象，取平均时间)，从而对比2种处理组中F5代大型蚤在8.0 mg·L-1As(V)暴露条件下的抗性大小。

1.3.2 F5代生物适应性参数

F5代生物适应性参数选择以下5个指标：1)繁殖第一批所需时间(time to first brood)；2)繁殖力(fecundity)，即每只大型蚤一生繁殖的后代总数；3)繁殖次数(broods)，即每只蚤一生共繁殖几批；4)平均每批产仔量(average brood size)；5)寿命(life span)。

具体试验操作如下：随机选择了处理组中的S1～S3与对照组中的C1、C3进行对比。即分别从S1～S3和C1、C3中的第五代(F5)大型蚤中各随机选择10只大型蚤幼蚤(<24 h)，每杯1只转入50 mL小烧杯中，每个小烧杯内含30 mL干净不加砷的硬水，喂食少量蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)，直至生命结束。期间每24 h记录1次，最终得到每只蚤在整个生命周期中的繁殖情况，从而对比2种处理组中F5代大型蚤的5种生物适应性参数。

1.4 数据分析

采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行数据分析并作图，用T Test检验对选择组与对照组之间各试验结果的差异进行统计学分析。数据结果用平均值±标准误(mean±standard error,S.E.)来表达。

2 结果（Results）

2.1 急性毒性试验

由图1可知，大型蚤对As(V)的96 h半致死浓度为4.25 mg·L-1。多代选择试验选择8.0 mg·L-1的As(V)浓度对大型蚤进行暴露，期待在2 d时间内快速选择到约50%对砷抗性强的个体，以便成功完成整个传代筛选过程。

2.2 多代抗性选择试验

2.2.1 F5代存活时间分析

经过五代抗性筛选试验以后，将选择组F5代与对照组F5代大型蚤幼蚤(<24 h)(n=40～50)均暴露于8.0 mg·L-1的As(V)溶液中，分别记录每只大型蚤的死亡时间。分别将2种处理中的各个平行之间的数据整合进行分析，结果显示选择组F5代与对照组F5代大型蚤相比存活时间显著延长175% (P<0.01)(图2)。

图2 对照组与选择组中的F5代大型蚤在8 mg·L-1As（V）暴露下的存活时间（n=40～50，∗∗P＜0.01）

图3 选择组与对照组F5代大型蚤的生物适应性参数

2.2.2 F5代生物适应性参数分析

在所选择的生物适应性参数中，与对照组F5相比，选择组F5大型蚤的繁殖力(fecundity)明显下降19.96%(P<0.05)(图3a)，平均每批产仔量(average brood size)显著减少15.71%(P<0.01)(图3b)。而选择组F5大型蚤的繁殖次数(broods)、繁殖第一批所需时间(time to first brood)及平均寿命(life span)与对照组F5相比均没有明显改变(图3c～e)。

3 讨论（Discussion）

3.1 急性毒性试验

在多代选择试验开展之前，预先设计了急性毒性试验并得到大型蚤对As(V)的96-h LC50为4.25 mg·L-1，因此，选择8.0 mg·L-1的As(V)浓度进行人工选择试验，以便在2 d时间内能将约50%～60%的幸存大型蚤转移至干净不加砷的硬水中。大型蚤稳定后的最终存活率为30%～50%，待其生长繁殖出下一代(F1)。将F1幼蚤(<24 h)重复上述选择过程至获得F5代大型蚤终止试验。所选8.0 mg·L-1的浓度可以成功完成整个选择过程，而4.25 mg·L-1的96-h LC50数值也和有关报道中的数据相符合。例如，Valenti等[19]报道大型蚤对As(V)的48-h LC50为4.32 mg·L-1。而Enserink等[20]在半静止条件下所得到的大型蚤21-d LC50为5.80 mg·L-1(硬度225 mg·L-1，以CaCO3为标准)。

3.2 多代选择试验

经过8.0 mg·L-1的As(V)五代暴露选择后，与对照组F5相比，选择组F5代大型蚤在8.0 mg·L-1的As(V)环境下的存活时间显著延长(图2)，说明经过五代人工选择以后，选择组F5代大型蚤获得了对As(V)的抗性。然而，这种抗性的获得伴随有生物适应性参数的降低为代价。大型蚤可能是通过减少繁殖后代的数量(平均每批产仔量及总繁殖数量)来应对砷环境的胁迫压力(图3a,b)。可以推测减少繁殖数量可以减少生物体的营养消耗，以便在不利的环境中保证生存能量。但是，从长期进化的角度来看，生物适应性代价也可能会导致抗性生物群体最终的灭绝。

在自然条件下，自然选择是一个非常缓慢的过程。由于大型蚤生命周期短、繁殖速度快，有助于在实验室条件下模拟该选择过程。由结论可以推断，在长期暴露的污染环境下，经过多代选择以后，一些生物可能进化出对某污染物的抗性及遗传性，以便在该环境中生存下来，这源于物种生存并繁衍的一种适应机制。有关水生生物对污染物抗性进化的研究已有报道。Ward和Robinson[15]报道了大型蚤经过八代选择后成功获得到了对镉(Cd)的抗性，但是镉抗性大型蚤伴随有很高的生物适应性代价。比如体型(size)减小、基因多样性(genetic variation)降低、对其他有毒物质(如苯酚)更敏感等。研究还发现，选择力太弱(即太多的个体选为亲代)或太强(即太少的个体选为亲代)都可能得不到抗性结果，选择太弱可能无法使进化现象发生，选择太强会导致存活个体无法维系群体稳定性，不利于传代选择的继续。除重金属污染的毒理学研究之外，化学药品对大型蚤的多代慢性毒性效应也有报道。Dietrich等[16]将大型蚤暴露于氨甲酰氮草、双氯高灭酸、乙炔雌二醇和美托洛尔4种不同化学药品时发现，在六代慢性选择过程中，大型蚤的体长、产卵量、第一次产卵时间等均受到不同程度的影响。杨晓凡等[17]用磺胺甲恶唑、氧氟沙星和布洛芬3种药品对大型蚤也进行了六代慢性毒性研究，结果显示，环境相关浓度的药品暴露对大型蚤的生长繁殖没有显著影响，而当浓度升高或混合暴露时，大型蚤会表现出一定的毒性响应，如：第一次产卵时间延迟、产卵数量减少等。

随着分子生物学技术的发展，金属硫蛋白(metallothionein,MT)、抗氧化酶等生物标志物也广泛应用于毒理学的研究中。MT是一种富含半胱氨酸的低分子量的小蛋白，能够有效清除体内由氧化压力产生的自由基，并对重金属污染物的解毒有着重要的作用[21]。张融等[22]的研究发现，将大型蚤暴露于不同浓度的镉(Cd)和锌(Zn)，蚤体内MT的含量随着2种重金属浓度的增加而升高，说明MT参与了Cd和Zn的解毒过程，从而减轻对机体的伤害。将大型蚤暴露于富含锌和铜的环境中，生物体内过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)等活性增加[23]。因此，本研究中的大型蚤经过As(V)多代选择，MT及抗氧化剂可能也参与了对砷的解毒作用，即使获得砷抗性，仍然对机体造成可能性损伤。也有可能是解毒的过程消耗了大量能量，以减少繁殖后代的数量作为代价。

综上所述，大型蚤经过五代选择后可以进化出对As(V)的抗性，这种抗性是以降低繁殖力及平均每批产仔量为代价实现的。未来研究应该着重于以下几个方面：(1)这种抗性是否具有遗传性，即As抗性是否可以遗传给下一代；(2)大型蚤As抗性的内在机理，如对砷的吸收、排出及解毒等方面的研究；(3)具砷抗性的大型蚤对其他污染物的敏感性研究，该方面的研究可以帮助了解共同抗性及抗性代价等。

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Rapid Evolution of Resistance to As（V）in Daphnia magna

Li Lixia,Li Dan,Gao Mi,Mu Lei,Chen Hongxing,Xie Lingtian*

Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering,Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016,China

22 July 2015 accepted 17 September 2015

Metal contamination can exert a strong selection force on the populations inhabiting in the metal contaminated environments.The populations will either survive in the contaminated environments by evolving the resistance to the metal(s)or go extinction in such contaminated environments.Artificial selection approach can be used to study the potential of evolution of resistance to metals in organisms.To understand whetherDaphnia magna can evolve the resistance to arsenate(As(V)),an artificial selection was used to study responses of daphnids to the selection of As(V)resistance in a multi-generation selection regime.Based on the 96-h LC50of As(V)(4.25 mg· L-1),D.magnawere exposed to a sublethal concentration(8.0 mg·L-1)of As(V).In each generation,survivors from the As(V)exposure(i.e.,As-tolerant individuals)(approximately 30%-50%)were allowed to produce offspring in the next generation.The artificial selection was repeated for 5 generations.The resistance to As(V)wasquantified and fitness costs associated with the resistance to As(V)were evaluated in the F5 generation.The results showed that the selected group had a longer(175%)time to death than that of control,implying that daphnids might have evolved the resistance to As(V).Comparison of the data on the fitness components showed that the Asresistant daphnids had a reduced fecundity(19.96%)and a decreased average brood size(15.71%)than the control daphnids.It was concluded that the daphnids could have evolved the resistance to As(V)exposure even after five generations of artificial selection.And the rapid evolution of resistance to As(V)inD.magnamight be associated with fitness costs.Further research is needed to elucidate the underlying mechanisms(including accumulation and the detoxification of As(V))for this resistance inD.magna.

As(V);Daphnia magna;resistance;multiple generations;fitness

2015-07-22 录用日期：2015-09-17

1673-5897（2016）3-237-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150722001

简介：谢凌天(1969—)，男，生物学博士，研究员，主要研究方向为金属及新型污染物在淡水生物中的累积及毒性效应。

国家自然科学基金面上项目(31270549)；中国科学院“百人计划”项目

李莉霞(1986-)，女，博士研究生，研究方向为环境毒理学，E-mail:lilixia77@126.com

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:xielt@iae.ac.cn