三邻甲苯磷酸酯对大鼠C6星形胶质细胞的氧化损伤和细胞周期阻滞作用

刘晓晖，李双月，刘琦，朴丰源，邵静，李亚晨，薛鹏

大连医科大学公共卫生学院，大连116044

三邻甲苯磷酸酯对大鼠C6星形胶质细胞的氧化损伤和细胞周期阻滞作用

刘晓晖，李双月，刘琦，朴丰源，邵静，李亚晨*，薛鹏

大连医科大学公共卫生学院，大连116044

三邻甲苯磷酸酯(tri-o-cresyl phosphate,TOCP)是一种有机磷酸酯类化合物，具神经毒性作用。研究表明星形胶质细胞是有机磷化合物(organophosphorus compounds,OPs)神经毒性作用的靶点之一。为了探讨TOCP对星形胶质细胞的毒性作用，采用大鼠C6星形胶质细胞分别经0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP染毒处理24 h，应用MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)活力分析法检测细胞活力，在电子相差显微镜下观察细胞形态，二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)比色法测定谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，流式细胞仪检测分析细胞周期。结果显示，经TOCP处理24 h后，大鼠C6星形胶质细胞存活率降低，LDH释放增加，细胞形态也发生了明显的变化。GSH含量和GSH-Px活性降低，G1期细胞数量也逐渐增加。上述结果表明，TOCP对星形胶质细胞具有毒性作用，引起氧化损伤和细胞周期阻滞。

三邻甲苯磷酸酯；大鼠；星形胶质细胞；细胞毒性；氧化应激；细胞周期阻滞

刘晓晖,李双月,刘琦,等.三邻甲苯磷酸酯对大鼠C6星形胶质细胞的氧化损伤和细胞周期阻滞作用[J].生态毒理学报，2016,11(3):151-156

Liu X H,Li S Y,Liu Q,et al.Oxidative damage and cell cycle arrest in rat C6 astroglial cells induced by tri-ortho-cresyl phosphate[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):151-156(in Chinese)

磷酸三甲苯酯(tricresyl phosphate,TCP)是一种有机磷酸酯类化合物。由于其具有化学和热稳定性，工业上常作为增塑剂、软化剂、阻燃剂和机油添加剂等广泛使用[1-2]。三邻甲苯磷酸酯(tri-o-cresyl phosphate,TOCP)是TCP三个同分异构体(间位、邻位和对位)中的邻位异构体，具神经毒性、生殖毒性和免疫毒性，主要引起迟发性中毒性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN)[3]。因此，多年来有关TOCP神经毒性作用的研究大多集中在神经元上，并围绕TOCP诱导OPIDN的机制展开[4-5]。

星形胶质细胞，是哺乳动物脑内分布最广、数量最多的一类细胞，在脑内被认为仅起支持和营养等保护功能。随着对星形胶质细胞研究的不断深入，人们逐渐认识到星形胶质细胞还在神经系统发育、突触传递、神经系统内环境的稳定和新陈代谢等中枢神经系统(CNS)多种生理活动中，以及神经组织的修复与再生、神经免疫和多种神经系统疾病的病理机制中都起着十分重要的作用[6-8]。

近年来研究表明，星形胶质细胞是许多有机磷化合物神经毒性作用的直接靶标。Guizzetti等[9]报道了有机磷农药毒死蜱等及其氧化代谢产物以浓度依赖的方式抑制星形胶质细胞的增殖。Garcia等[10]通过体外研究也发现，毒死蜱能够抑制C6胶质细胞的复制、分化及诱导氧化应激，并且证实有机磷还干扰神经胶质的发育模式。Pizzurro等[11]等报道，二嗪农及其分解产物异丙嘧磷(diazoxon)增加星形胶质细胞氧化损伤，降低星形胶质细胞促海马神经元突触生长的能力。有关TOCP对星形胶质细胞毒性作用尚未见报道。本研究就TOCP对星形胶质细胞的毒性作用进行初步研究，以期发现TOCP神经毒性作用的新靶标。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 实验材料

大鼠C6星形胶质细胞购于中科院上海细胞所细胞库。TOCP(纯度>99%)购自日本Kanto化学有限公司；MTT购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；青霉素、链霉素、LDH、GSH和GSH-Px检测试剂盒及细胞周期检测试剂盒购自杭州碧云天生物技术研究所；其他试剂均为国产分析纯试剂。

CO2培养箱和354型多功能酶标仪购自美国Thermo公司；F-2700型荧光分光光度计购自日本Hitachi公司；FACSAria II流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与处理

细胞在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素和100 mg·mL-1链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期的细胞进行实验，实验分组为0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP染毒组及对照组。

1.2.2 MTT比色法检测细胞存活率

选取状态良好的对数期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液并计数。调整细胞浓度为1×105cell·mL-1接种于96孔板中，每孔0.1 mL，24 h后进行染毒处理，每个浓度设6个平行孔。染毒24 h后，每孔加入10 μL的MTT(浓度为5 mg·mL-1)，继续培养4 h后，弃上清液，加入二甲亚砜100 μL，振荡20 min，使紫色结晶完全溶解，用酶标仪在570 nm处测定OD值。细胞存活率(%)=(OD实验组-OD本底对照)/(OD对照组-OD本底对照)×100%。

1.2.3 LDH漏出率检测

细胞以1×106cell·mL-1的密度接种在24孔板中。24 h后，加入不同浓度的TOCP染毒处理24 h，然后分别收集细胞和培养液，按照LDH检测试剂盒说明书测定胞内和胞外乳酸脱氢酶活力。细胞LDH漏出率(%)=(OD胞外-OD对照)/[(OD胞内-OD对照) +(OD胞外-OD对照)]×100%。

1.2.4 细胞形态的观察

细胞形态学改变在倒置相差显微镜下观察并拍照。

1.2.5 GSH含量和GSH-Px活性检测

C6细胞以1×106cell·mL-1的密度接种在6孔板中。24 h后，加入不同浓度的TOCP染毒处理24 h，然后分别收集细胞。细胞用冷PBS洗2次后匀浆，在4℃、1 000 g离心10 min，取上清液用于测定GSH-Px活性和GSH含量。蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定，用牛血清白蛋白作标准曲线。

1.2.6 细胞周期分析

C6细胞以1×106cell·mL-1的密度接种在60 mm细胞培养皿中。24 h后，加入不同浓度的TOCP染毒处理24 h，然后1 000 g下离心5 min。收集细胞，用预冷的PBS洗细胞2次，再加入预冷的70%乙醇中，4℃过夜固定。1 000 g下离心5 min，收集细胞，用预冷的PBS洗细胞2次，加入0.5 mL碘化丙啶染色液(按试剂盒说明书配制)重悬细胞沉淀，37℃下避光温浴30 min，用流式细胞仪进行检测与分析。

1.2.7 统计分析方法

用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。数据表示为平均值±标准差(standard deviation,SD)，组间比较采用单因素方差分析，实验组与对照组比较采用LSD检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果（Results）

2.1 细胞存活率检测结果

与对照组相比，暴露于0.1、0.3、1.0和3.0 mmol· L-1TOCP的大鼠C6星形胶质细胞存活率以剂量依赖的方式降低，细胞存活率分别为：89.84%±4.9%，75.11%±4.0%，57.46%±3.9%，42.02%±5.2%(图1)。

2.2 细胞LDH漏出率检测结果

TOCP染毒增加LDH漏出率，并且随着染毒剂量的增加LDH漏出率显著增加。0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP暴露，大鼠C6星形胶质细胞LDH漏出率分别为：112.13%±7.3%、131.96%±4.7%，163.18%±5.2%和189.22±7.8%(图2)。

2.3 细胞形态特征

倒置相差显微镜下可见，正常组细胞为梭形，大小、形态基本相同，具有清晰的轮廓。TOCP染毒后，细胞形态发生很大的变化。随着TOCP浓度的增加，异型细胞增多，细胞胞体明显皱缩，细胞核凝集，有的细胞膜破裂，甚至有的细胞破碎(图3)。随着TOCP浓度的增加，细胞数量也见明显减少(图3)。

图1 三邻甲苯磷酸酯（TOCP）对大鼠C6星形胶质细胞存活率的影响

图2 TOCP对大鼠C6星形胶质细胞LDH漏出率的影响

图3 TOCP对大鼠C6星形胶质细胞形态的影响

图4 TOCP对大鼠C6星形胶质细胞GSH含量的影响

图5 TOCP对大鼠C6星形胶质细胞GSH-Px活性的影响

2.4 GSH含量和GSH-Px活性检测结果

0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP暴露，破坏大鼠C6星形胶质细胞抗氧化系统，使GSH含量和GSH-Px活性降低。但0.1 mmol·L-1TOCP暴露使GSH含量和GSH-Px活性降低与对照组相比较没有统计学意义。

2.5 细胞周期检测结果

细胞周期检测结果显示，与对照相比较，暴露0.1、0.3、1.0和3.0 mmol·L-1TOCP大鼠C6星形胶质细胞G1细胞数量以剂量依赖的方式增加。

3 讨论（Discussion）

众所周知，TOCP具神经毒性作用，OPIDN是TOCP神经毒性作用最主要的症状，因此，过去的研究主要集中在TOCP诱发的迟发性神经毒性上。然而，近来研究显示，星形胶质细胞也是某些有机磷化合物神经毒性作用的靶点[9-11]。Guizzetti等[9]用胎鼠星形胶质细胞和人星形胶质瘤细胞系研究有机磷农药毒死蜱、二嗪农、对硫磷及其氧化代谢产物对细胞增殖的影响，台盼蓝染色结果显示，有机磷农药及其氧化代谢物具明显的细胞毒性。本研究应用MTT比色法和LDH活力分析法检测细胞活力，发现TOCP明显降低大鼠C6星形胶质细胞的生存率，并增加LDH漏出。TOCP染毒后，细胞形态也发生很大的变化，异型细胞增多，细胞胞体明显皱缩，细胞核凝集，有的细胞膜破裂，甚至有的细胞破碎。这些实验结果表明，TOCP对星形胶质细胞具有毒性作用。

氧化应激是引起细胞死亡的主要原因之一[12-13]。许多外源化学物进入机体后可以产生氧自由基引起氧化损伤。龙鼎新等[14]报道了TOCP暴露使人成神经瘤细胞SH-SY5Y的细胞丙二醛(MDA)的含量增高，过氧化氢酶(CAT)含量降低。Zhang等[15]研究发现，TOCP使鸡神经组织脂质过氧化水平升高，并降低超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、GSH-Px等抗氧化酶的活性，减少GSH含量。GSH和GSH-Px是生物体内重要的抗氧化物和抗氧化酶，在保护机体免受氧化应激和清除自由基的过程中起重要作用。GSH-Px能催化多种过氧化物生成H2O和O2。GSH可直接清除自由基，还可通过与其他抗氧化剂相互作用，促进其再生和再循环，其在调节细胞氧化还原稳态具有重要作用。因此，GSH含量和GSH-Px活性的改变可间接反映出细胞抗氧化防御系统的状态。星形胶质细胞是大脑重要的抗氧化防御系统，GSH含量和GSHPx活性很高[16-17]。本研究调查了TOCP对大鼠C6星形胶质细胞GSH含量和GSH-Px活性的影响，结果显示，TOCP暴露降低细胞GSH含量和GSH-Px活性，这一结果提示，TOCP可以引起星形胶质细胞细胞内抗氧化能力减弱，使细胞易受到自由基等的损伤。TOCP对星形胶质细胞活力的影响可能与其对细胞的氧化损伤有关。

图6 TOCP对大鼠C6星形胶质细胞细胞周期的影响

Long和Wu[18]报道了TOCP抑制人成神经瘤细胞SH-SY5Y生长，诱导G1期细胞周期阻滞。Guizzetti等[9]也发现有机磷农药毒死蜱等及其氧化代谢产物对星形胶质细胞毒性作用部分归因于抑制[3H]胸苷的掺入，抑制DNA合成。本研究我们发现，大鼠C6星形胶质细胞经TOCP染毒处理后，G1期细胞数量随TOCP浓度增加而增加。

神经元生存在一个复杂的微环境中，星形胶质细胞对神经元微环境具有调控的能力。它通过合成分泌某些神经营养因子和细胞因子改变神经元周围的微环境，参与神经递质的代谢，稳定神经递质的稳态，对维持神经元的生存、发育、再生和分化起重要作用。同时，它富含抗氧化物和抗氧化酶，可保护神经元免受氧自由基诱导的损伤。研究表明受到损伤的星形胶质细胞无神经营养作用。Pizzurro等[11]等报道，二嗪农及其分解产物diazoxon增加星形胶质细胞氧化损伤，降低星形胶质细胞促海马神经元突触生长的能力。本研究我们发现TOCP对星形胶质细胞具毒性作用，引起氧化应激和细胞周期阻滞。鉴于星形胶质细胞对神经元生存的重要作用，TOCP对星形胶质细胞损伤在其神经毒性中的作用与机制有待进一步研究。

（References）：

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Oxidative Damage and Cell Cycle Arrest in Rat C6 Astroglial Cells Induced by Tri-ortho-cresyl Phosphate

Liu Xiaohui,Li Shuangyue,Liu Qi,Piao Fengyuan,Shao Jing,Li Yachen*,Xue Peng

School of Public Health,Dalian Medical University,Dalian 116044,China

15 July 2015 accepted 17 September 2015

Tri-ortho-cresyl phosphate(TOCP),an organophosphorus ester can cause neurotoxicity.Recent studies show that astrocytes are also an important target for many organophosphorus compounds(OPs)neurotoxicity.This study aims to investigate a possible cytotoxic effect of TOCP on astrocytes in vitro.Rat C6 astroglioal cells were exposed to 0,0.1,0.3,1.0 and 3.0 m mmol·L-1TOCP for 24 h.Then cell viability was measured by MTT assay and lactate dehydrogenase(LDH)leakage.The cell morphological change was observed using light microscopy. The content of glutathione(GSH)and the activity of glutathione peroxidase(GSH-Px)were also analyzed by 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid(DTNB)chromatometry.Cell cycle progression was determined by flow cytometry. Exposure to TOCP caused decrease in cell viability,increase in LDH leakage,morphology change,decrease in the content of GSH and the activity of GPx and the G1 phase cell cycle arrest.These results suggested that TOCP hascytotoxicity effect and cause oxidative damage and phase cell cycle arrest on astroglial cells.

TOCP;C6 cells;cytotoxicity;oxidative stress;cell cycle arrest

2015-07-15 录用日期：2015-09-17

1673-5897（2016）3-151-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150715002

简介：李亚晨(1965—)，女，博士，副教授，主要研究方向为药理毒理学。

辽宁省自然科学基金(2013023054)；大连医科大学本科教学改革研究项目(DYLX13036)

刘晓晖(1981-)，女，博士，副教授，研究方向为生态毒理学，E-mail：liuxh892@126.com；

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:liy76@yahoo.com;2461178934@qq.com