毕赤酵母产木聚糖酶发酵条件优化及其酶学特性研究

徐志旭，袁丽娟，卢洪栋，潘春梅*

（1.河南牧业经济学院生物工程学院，河南郑州450046；2.郑州市农产品质量检测流通中心，河南郑州450006）



毕赤酵母产木聚糖酶发酵条件优化及其酶学特性研究

徐志旭1，袁丽娟2，卢洪栋1，潘春梅1*

（1.河南牧业经济学院生物工程学院，河南郑州450046；2.郑州市农产品质量检测流通中心，河南郑州450006）

本研究在50 L发酵罐水平上对毕赤酵母产木聚糖酶发酵条件进行优化，并对其酶学特性进行研究。利用单因素试验系统考察了微生物种龄、诱导时机、诱导培养温度和诱导时期pH值对产木聚糖酶的影响。结果表明：在最佳种龄23 h、发酵液细胞湿重121 g/L左右开始诱导，诱导培养温度26℃，诱导时期维持pH值5.6的优化工艺条件下，木聚糖酶酶活可达到47570 U/mL；酶的最适反应pH值为5.0～6.0，且具有较好的耐热性，85℃作用2 min后酶活收率仍可达到87.8%，能够用于饲料高温制粒。

毕赤酵母；木聚糖酶；发酵；优化；酶学性质

木聚糖酶是指专一降解木聚糖为寡木聚糖、低聚木糖、木二糖和木糖的一组酶的总称（刘波等，2014；吴萍等，2012）。当木聚糖酶用作饲料酶制剂时，可以提高畜禽对饲料的转化效率，促进养分的消化吸收，促进动物生长，有利于维持肠道微生态平衡并可降低污染。

木聚糖酶在工业化生产前进行发酵条件优化，可提高菌株产酶水平，降低生产成本，提高经济效益。本研究在50 L发酵罐水平上对毕赤酵母发酵产木聚糖酶的工艺条件进行优化并对其酶学性质进行研究，为酸性耐高温木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种毕赤酵母（Pichia pastoris），河南牧业经济学院保存。

1.1.2主要试剂D-木糖、木聚糖均购自Sigma试剂公司；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、甲醇均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3培养基种子培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏1 g/L，蛋白胨2 g/L，121℃灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏1 g/L，蛋白胨2 g/L，吐温-80 2 g/L，121℃灭菌30 min。

1.2试验方法

1.2.1发酵方法取一环斜面菌种接至摇瓶种子培养基中，28℃、230 r/min培养24 h，将种子液按10%接种量接至5 L种子罐中，培养一定时间后转接于50 L发酵罐培养144 h，通气比为1∶1，转速为600 r/min，发酵温度为28℃。

1.2.2细胞湿重检测方法称取空离心管重量，然后取10 mL发酵液至离心管中，4500 r/min离心5 min，弃上清液，称重后减去空管重量并换算成细胞湿重（g/L），每次三个平行。

1.2.3还原糖检测方法采用DNS方法检测还原糖含量。

1.2.4木聚糖酶活力测定方法将发酵液以10000 r/min离心5 min，取上清粗酶液测试酶活。采用国标GB/T 23874-2009检测木聚糖酶的活性。在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活性单位（U）。

2　结果与讨论

2.1木聚糖酶发酵条件优化

2.1.1种子生长曲线及种龄的确定在微生物发酵过程中，培养高活力的种子是非常重要的环节。如种龄太短，往往会出现延迟期过长，致使发酵周期延长；如种龄过长，发酵过程中菌体容易过早自溶，导致生产能力下降。通常选择处于对数生长期后期生长极为旺盛的菌体作为种子。在5 L种子罐中培养毕赤酵母，图1显示的生长曲线反映了微生物在生长代谢过程中细胞重量、残糖和溶氧量（DO）的变化情况。

图1　种子生长曲线

由图1可见，当接种10 h后，发酵液中残留的还原糖持续下降，在20～24 h期间还原糖下降速度比较快。溶氧量DO值在20～21 h快速下降后趋于平稳，并于24 h后快速上升。从细胞湿重看微生物生长量，也显示出23～24 h为对数生长期的后期，细胞生长量接近最高值。综合考量上述三个指标，最佳的种龄确定为23 h。在工业生产中也可以控制在残糖＜1%、湿重70～80 g/L、DO值降至最低点后开始回升时为最佳接种时间。

2.1.2诱导时机对木聚糖酶活力的影响甲醇能够诱导外源基因在毕赤酵母中表达。将种子培养液按10%的接种量接种于50 L发酵罐培养基中，培养细胞湿重分别为113、121、133、142 g/L时加入1%甲醇进行诱导，28℃下继续培养24 h，检测木聚糖酶活力。

由图2可以看出，添加甲醇的时机对产木聚糖酶影响较大，当细胞湿重在113 g/L时添加甲醇，菌体量少，不利于目标蛋白的积累，木聚糖酶表达效果较差；当细胞湿重在121 g/L时开始诱导可以得到较高的表达水平，经过诱导培养24 h后，酶活到达1896 U/mL，随着湿重的提高，酶活也随之增长但幅度不大。生产中为了实现产出最大化，选择细胞湿重在121 g/L时进行诱导表达。

图2　诱导时机对木聚糖酶活力的影响

2.1.3诱导培养温度对木聚糖酶活力的影响代谢类发酵一般会选择不同的控制温度，较多采用变温发酵。对于毕赤酵母菌体生长最适温度为28℃，诱导表达的最适温度通常更低，常为20～28℃，尤其是分泌蛋白，低温可以降低折叠压力，有利于新生多肽链的正确折叠，更有利于表达（Daly等，2005）。此外还可以降低菌体死亡率，提高乙醇氧化酶活性和转录水平，提高蛋白稳定性。毕赤酵母在诱导阶段温度分别维持在20、21、22、23、24、25、26、27、28℃进行诱导培养，全程每隔12 h检测一次酶活，以木聚糖酶活力最高点进行对比，结果如图3所示。

图3　诱导培养温度对木聚糖酶活力的影响

由图3可知，对于本株产木聚糖酶的毕赤酵母，最佳诱导培养温度为24℃，此时木聚糖酶活力最高可达到46393 U/mL；低于24℃时木聚糖酶活力明显降低，可能是由于低温诱导时，对菌株内其他酶的活性有抑制作用；当高于24℃则显示不出蛋白正确折叠的优越性，木聚糖酶活力缓慢减少。考虑发酵毕赤酵母过程中低温控制会造成水资源及电力的过度消耗，因此发酵生产中诱导后的培养温度控制在26～27℃较为合理。

2.1.4诱导时期不同pH值对木聚糖酶活力的影响pH值对毕赤酵母菌体生长和诱导表达都会产生重要影响，在添加甲醇诱导后，设定诱导培养温度为26℃，控制发酵过程中pH值分别维持在5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，酶活检测结果如图4所示。

图4　诱导时期不同pH值对木聚糖酶活力的影响

由图4可知，诱导时控制不同的pH值，不仅影响酶的表达量和活性，而且会影响其降解程度。诱导时期维持pH 5.6时能够更好地刺激产酶，木聚糖酶活力最高达到47570 U/mL，这可能是当pH为5.6时能使毕赤酵母代谢产木聚糖酶过程中的相关酶系达到较高活力。

2.2木聚糖酶的酶学性质

2.2.1木聚糖酶的最适反应pH值将木聚糖酶在37℃下于pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下分别与木聚糖反应30 min，测定酶活性。由图5可知，木聚糖酶的最适反应pH值为5.0～6.0，pH为4.5～6.5较为稳定。在pH 4、37℃下保存30 min，酶活仅剩65.7%。

图5　不同酶促反应pH值对木聚糖酶活力的影响

2.2.2木聚糖酶对高温的耐受性木聚糖酶作为饲料添加剂使用时，在饲料制粒过程中需要经历高温高湿，时间虽然短暂但对于其耐热性提出了较高的要求。本研究对毕赤酵母产生的木聚糖酶进行耐热性研究，将木聚糖酶分别在75、80、85、90℃条件下作用2 min后，于37℃、pH 5.5条件下与木聚糖反应30 min，检测其酶活性。高温处理前原始样品初始酶活为51023 U/g。由图6可以看出，该酶拥有较好地耐热性，经75℃和80℃处理后，木聚糖酶活力稍有降低，酶活收率能达到95%以上，当温度升高至85℃，酶活收率仍保持在87%以上。但当温度升至90℃时，酶活力骤然下降至29820 U/g，酶活收率仅为58%。为保证酶活收率，饲料制粒时温度应控制在85℃以下。

图6　高温处理对木聚糖酶活力的影响

3　结论

3.1微生物种龄、诱导时机、诱导培养温度、诱导时期pH值对毕赤酵母产木聚糖酶有显著影响。在种龄23 h、发酵液细胞湿重121 g/L左右开始诱导，诱导培养温度26℃、诱导时期维持pH值5.6的优化工艺条件下，木聚糖酶活力可达到47570 U/mL。

3.2该木聚糖酶的最适反应pH值为5.0～6.0，且具有较好的耐热性，在85℃处理2 min后酶活收率仍可达到87.8%，能够用于饲料高温制粒。

［1］刘波，邬应龙，张霞，等.红曲霉固态发酵产木聚糖酶培养基的响应面优化［J］.食品工业科技，2014，35（1）：254～258.

［2］吴萍，李正鹏，何庆元，等.金针菇固态发酵产木聚糖酶的纯化及其性质研究［J］.药用生物技术，2012，19（1）：31～34.

［3］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 23874-2009［S］.中华人民共和国国家标准——饲料添加剂木聚糖酶活力的测定.北京：中国标准出版社，2009-05-26.

［4］Daly R，Hearn M T W.Expression of heterologous proteins in Pichia pnstoris：a useful expression tool in protein engineering and production［J］.J Mol Recognit，2005，18（2）：119～38.

The optimization of fermentation conditions and the enzymatic properties of xylanase produced by Pichia pastoris were studied in 50 L fermentor.The effects of cell age，the time of induction，temperature and pH of induction culture on expression of xylanase were investigated.The optimum parameters of xylanase fermentation were：the optimal cell age of 23 h，methanol added when wet cell weight reached 121 g/L，induction temperature of 26℃，maintain pH of induction culture 5.6.Under above conditions，the xylanase reached an activity of 47570 U/mL.The optimal working pH value of xylanase was 5.0～6.0，and it had good heat resistance，the rate of enzyme activity could remain 87.8%at 85℃for 2 min. The xylanase could be used for feed granulation at high temperature.

Pichia pastoris；xylanase；fermentation；optimization；enzymatic properties

S816.6

A

1004-3314（2016）06-0018-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160605

河南牧业经济学院科技创新团队项目（HUAHE2013001）；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目（2010GGJS-193）