堆肥过程中纤维素酶活与纤维素降解相关研究

李洪涛，王　涵，臧翔云，刘美庭（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

堆肥过程中纤维素酶活与纤维素降解相关研究

李洪涛，王涵，臧翔云，刘美庭
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

采用室内小型堆肥反应器堆肥，测定CMC酶活性和β-葡萄糖苷水解酶活性，测定堆肥物料中纤维素、半纤维素和木质素相对含量，利用高效液相法测定葡萄糖和纤维二糖。结果表明，堆肥过程中，堆体温度前3 d迅速上升至45℃，进入高温期，维持8 d后进入降温期，最后与环境温度变化一致；β-葡萄糖苷水解酶活性第4天达最大值（1.482μmol p-Nitr·g-1DW·min-1），并在降温腐熟期维持在0.429~0.533μmolp-Nitr·g-1DW·min-1范围内；CMC酶活性变化趋势与β-葡萄糖苷水解酶活性相似，并在第7天达最大值（47.67μg glucose·g-1DW·min-1）；纤维素和半纤维素降解趋势相似，均在高温期降解明显；木质素相对含量总体变化较小，且在降温腐熟期小幅增加。结果显示，CMC酶活性与纤维素和半纤维素降解呈正相关。

堆肥；CMC酶；β-葡萄糖苷水解酶；高效液相色谱法

网络出版时间2016-6-17 15:22:24[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1522.024.htm l

李洪涛,王涵,臧翔云,等.堆肥过程中纤维素酶活与纤维素降解相关研究[J].东北农业大学学报,2016,47(6):33-40.

Li Hongtao,Wang Han,Zang Xiangyun,et al.Correlation study on cellulose activities and ligocellulose degradation during composting[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):33-40.(in Chinese with English abstract)

高温好氧堆肥方式是我国当今处理农业固体废弃物诸如秸秆、稻草和禽畜类粪便等有效手段。多种有机物成分存在于堆肥基质中，纤维素、半纤维素和木质素等大分子物质是畜禽粪便和秸秆等农业废弃物主要成分[1]。这些大分子物质中，作物秸秆等纤维素类物质为微生物生长提供碳源。堆肥就是基质在微生物产生各种酶作用下，通过一系列分解反应，最后形成腐殖质过程。木质纤维素在牛粪堆肥中含量达50%~70%[2-3]，研究结果显示，木质素降解程度影响堆肥腐熟进程，是堆肥产品品质控制重要因素[3-6]。

可切断纤维素中β-1,4-葡萄糖苷键的多种功能酶总称纤维素酶，包括β-葡萄糖苷水解酶、葡聚糖外切酶、内切葡聚糖酶[7]。降解纤维素过程为内切葡聚糖酶切断纤维素多糖链成为不同长度寡糖链，再由羧甲基纤维素酶（CMC酶）等外切纤维素酶将寡糖链分解成纤维二糖。纤维二糖在β-葡萄糖苷水解酶的作用下分解成葡萄糖，被微生物直接吸收利用供其生长繁殖[8]。在微生物产生各种酶降解纤维素的一系列反应中，β-葡萄糖苷水解酶是限速酶[9]。

高效液相色谱法（High pressure liquid chroma⁃tography，HPLC）由传统液相柱层析方式演化而来，以高压下液体为流动相定性定量监测微量样品的技术手段，具有样品进样量微少、分析快速精准、适用范围广泛和预处理简单快捷等特点。孙雪等利用HPLC成功测得生殖培养液中葡萄糖含量[10]；李琦利用HPLC测定发酵乳中葡萄糖等成分含量，指出HPLC具有简便、快速及结果稳定等优点[11]；逯平杰等利用HPLC快速、准确测定甘蔗节间葡萄糖等成分含量[12]。

本研究通过对各时期β-葡萄糖苷水解酶与CMC酶活性及纤维二糖、葡萄糖含量测定，探讨堆肥过程中两种酶活性相关性，深入分析两种酶对基质纤维素降解影响，研究纤维素类物质在堆肥过程中降解生物学特性。

1　材料与方法

1.1材料

本试验采用小型实验室堆肥反应器将牛粪与稻草秸秆1ϑ3混合均匀后高温好氧堆肥，地点为东北农业大学资源与环境学院生物质资源化利用研究室。调节堆肥物料含水率（60%~70%）。堆肥周期为30 d，每天上午6:30，中午12:00，晚上19: 00对堆体通风并测定堆体距离顶端35 cm（上层）、65 cm（中层）和85 cm（下层）温度与环境温度。堆肥第8天、第16天和第23天翻堆。

1.2CMC酶与β-葡萄糖苷水解酶活性测定

两种酶活性测定参照文献[13]，取堆肥第0、1、4、7、13、23、29天新鲜样品测定酶活性。羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性测定方法：称取羧甲基纤维素钠盐0.625 g溶于醋酸钠缓冲液配置反应底物（CMC），用葡萄糖（Glucose）标准品（分析纯）配置成1mg·mL-1溶液，1mg·mL-1葡萄糖溶液分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，加入去离子水定容至2mL，分光光度计540 nm测定10个浓度梯度葡萄糖溶液吸光值，绘制葡萄糖标准曲线。称取新鲜堆肥样品2 g加入20mL去离子水中，摇床55℃100 r·min-1震荡1 h，取震荡后溶液4.5mL置于离心管中室温8 000 r·min-1离心15min。吸取离心后上清液1mL于试管中，吸取同体积去离子水作空白对照，将试验样品、空白对照及底物CMC溶液置于预热55℃水浴锅中水浴2min。将样品和对照取出后加入1.5mL醋酸钠溶液并调节pH至4.5，加入预热底物溶液4 mL，对照组不加底物以4mL预热去离子水代替。随后，将各试管置于55℃水浴锅中保温1 h，取出后立即加入1.5mL配置后过夜放置的DNS溶液终止酶促反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却，去离子水定容至25mL，540 nm波长测定吸光值，根据公式计算CMC酶活性[13]。

β-葡萄糖苷水解酶活性测定方法：以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物，将对硝基苯酚配置成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1mmol·L-110个浓度梯度，利用分光光度计测定400 nm吸光度，绘制对硝基苯酚标准曲线。取新鲜堆肥样品1 g加入5mL去离子水中，室温6 000 r·min-1离心20min，取上清液即粗酶液0.1mL，加入0.9mL醋酸缓冲液，置于预热55℃水浴锅中水浴5min后，加入同样55℃水浴5 min后PNPG溶液1 mL，静止放置20 min后加入1mLNa2CO3溶液终止反应，室温静置5min后，测定400 nm吸光度，计算β-葡萄糖苷水解酶活性[13]。

1.3纤维素、木质素和半纤维素含量测定

堆肥各时期样品纤维素、木质素和半纤维素相对含量利用美国安康半自动纤维分析仪测定。

1.4高效液相色谱法测定纤维二糖和葡萄糖含量

由于HPLC对溶剂要求较高，故试验过程使用超纯水。试验前1天做好流动相准备工作，吸取27μL浓硫酸加水定容至1 L后抽滤和超声波去泡。所有样品及标样均于试验当天配置完成并-20℃保存备用，防止样品中待测定成分发生降解影响测定结果。

称取0.01 g葡萄糖（分析纯），加水定容至10 mL制成标样备用，纤维二糖标样制备同理。称取2 g待测样品加入6mL水，4℃震荡30 min后取出，于4℃12 000 r·min-1离心15min，直径0.05 nm滤器处理上清液后待测。

1.5数据处理

试验采用Excel2007、DPS7.05和SPSS 21.0软件进行数据计算、绘图及统计分析。

2　结果与分析

2.1堆肥过程中温度变化

因人为控制秸秆与牛粪混合成分，堆体各部分温度存在一定时间空间差异，温度成为堆肥过程中堆体腐熟程度监测重要指标[14]。堆肥第0~2天，堆体平均温度迅速上升，这一阶段可定为升温期。第3天开始至堆肥第10天堆体始终维持45℃以上温度，由于自制小型堆肥反应器特殊性，在此可将堆肥过程中45℃以上时段定为高温期。第11天进入降温期，21 d进入腐熟期。升温期阶段，由于堆肥反应器因素，堆体热量不易散失，温度迅速升高。随温度升高，堆体内一些嗜热微生物生长繁殖迅速增加且代谢活动加快，使温度维持在堆肥过程的最高水平。微生物代谢活动随易被分解利用的有机物消耗而减弱，温度总体趋势下降。在降温腐熟期，温度呈稳定趋势，但与自然堆肥不同，小型堆肥反应器有保温作用，堆体温度变化受环境温度影响，但并不会迅速降低至环境温度。

堆肥第8、16和23天人工翻堆，使堆体充分混匀和为堆体提供氧气。各次翻堆后，温度呈小幅度下降后又回升趋势，说明翻堆后，堆体氧气含量大幅增加，微生物代谢活动有所增强。研究表明，温度变化在堆肥过程中影响微生物生长代谢，能反映堆肥进程[15]。

图1　堆肥过程中温度变化Fig.1 Change of temperature during com posting

2.2CMC酶活与β-葡萄糖苷水解酶活性研究

堆肥过程中人工营造小型生态环境，与自然环境类似，含碳类有机物质循环往复依赖微生物产生不同类型的酶对有机物质代谢分解。不同种类酶类调节相应底物代谢速率[16]，CMC酶与纤维素代谢有关。

如图2所示，堆肥初期，温度处于上升期，微生物代谢活力和代谢水平均处于较低状态，此时微生物仅利用简单易降解的小部分纤维素类有机物质，环境中可被利用的有机物质仅供微生物大量生长繁殖之用，无法产生大量酶类次生代谢产物，CMC酶活性在堆肥初始时较高，后呈大幅降低趋势。进入高温期后，堆体温度不断升高，微生物代谢水平也随之提高，大量酶类随微生物大量生长繁殖产生，堆体中小分子易降解有机物在升温期基本被消耗殆尽，意味微生物开始利用大分子纤维素类有机物分解代谢并使次生代谢产物大量积累，CMC酶活性逐渐升高。堆肥第7天 CMC酶活性为整个堆肥进程中最高值（47.67μg glucose·g-1DW·min-1），之后则逐渐降低，整个高温阶段，CMC酶活性均处于较高水平。进入降温腐熟阶段后，由于纤维素类有机物质被大量分解，微生物代谢活动减弱，CMC酶活性也随之下降，直至堆肥结束。

图2　CM C酶活及β-葡萄糖苷水解酶活性曲线Fig.2 Activities curve of CMCase and β-glucosidase

由图2可知，β-葡萄糖苷水解酶活性在堆肥过程中呈先升后降趋势。β-葡萄糖苷水解酶作用底物是纤维素类有机物分解产生的纤维二糖，因此在堆肥初始0~3 d，β-葡萄糖苷水解酶活性与CMC酶活性变化趋势一致。4~7 d，堆体中纤维二糖不断增加，β-葡萄糖苷水解酶活性维持较高水平（2.75~4.11μmolp-Nitr·g-1DW·min-1）。堆肥降温腐熟阶段，CMC酶活性降低，纤维二糖生成量降低，因此β-葡萄糖苷水解酶活性虽有一定起伏，但维持在较低水平（0.429~0.533μmol p-Nitr· g-1DW·min-1）。同时，堆肥降温腐熟期，酶活性降低与β-葡萄糖苷水解酶降解产物葡萄糖存在一定相关，众多研究证实β-葡萄糖苷水解酶活性受大量累积葡萄糖抑制[7,17]。

2.3木质纤维素相对含量

纤维素、半纤维素和木质素是牛粪和秸秆中纤维素类有机物主要成分，堆肥各时期采样测量其相对含量。

由图3可知，木质素在初始堆肥物料中相对含量最高为24.96%，半纤维素次之为23.16%，纤维素最低为18.32%。堆肥终止时其相对含量分别为13.09%、15.12%和26.88%。纤维素和半纤维素相对含量在堆肥过程中总体呈逐渐降低趋势且变化相似，CMC酶活性与之紧密相关。但由于堆肥物料中木质素相对于纤维素和半纤维素更难降解，其含量在堆肥过程稍有波动，但总体变化不大，甚至在降温腐熟期小幅增加。大量试验结果表明，木质素降解是限制植物细胞壁纤维素降解关键，是自然生态系统碳循环过程中重要环节[18]，与本试验过程中木质素相对含量变化相符。大量研究证实木质素是一类很难被分解代谢的有机物，在牛粪秸秆堆肥过程中仅小部分被微生物分解利用，与木质素相比，纤维素和半纤维素更易被微生物分解利用[19]。

由图3可知，纤维素和半纤维素相对含量在堆肥升温期和高温期（0~4 d）变化不明显，堆体温度在这一时期相对较低，各种分解纤维素和半纤维素微生物活动比较弱，主要依靠堆体中简单有机物生长代谢。此外，在这些微生物代谢活动中产生分解纤维素和半纤维素酶类也非常少，导致纤维素和半纤维素该时期降解程度低。

2.4葡萄糖和纤维二糖含量

试验采用浓硫酸和水混合体系作为流动相，利用HPX-87H色谱柱在柱温55℃，流速0.5mL·min-1，进样量10μL条件下监测葡萄糖和纤维二糖标准品色谱峰，如图4、5所示，葡萄糖标准品色谱峰保留时间为10.611min，纤维二糖色谱峰保留时间为8.631min。

图3　纤维素、半纤维素与木质素相对含量Fig.3 Relative contents of cellulose,hemicellulose and lignin

图4　葡萄糖标准品色谱Fig.4 Chromatographic chart of glucose

图5　纤维二糖标准品色谱Fig.5 Chromatographic chart of cellobiose

试验过程中分别取葡萄糖和纤维二糖分析纯标准品各0.01 g加入50μL超纯水中，并依次10倍稀释成3个梯度，将不同稀释浓度梯度标准品溶液分别加入同一堆肥样品中，以10μL进样量检测各梯度峰面积，计算两种葡萄糖和纤维二糖回收率，均达80%以上，说明两种标准品回收效率较好，此种检测样品中葡萄糖和纤维二糖含量方式可达到分离要求，并可应用于检测堆肥样品葡萄糖和纤维二糖含量。将堆肥样品逐一处理后进样，测得堆肥第0、1、4、7、13、23、29天色谱峰面积，如表1所示。

根据各时期样品色谱图显示色谱峰面积值，结合葡萄糖和纤维二糖标准品各浓度梯度峰面积值和试验中称取堆肥样品含量，计算各堆肥样品葡萄糖与纤维二糖含量（mmol·kg-1），如图6所示。

表1　样品高效液相色谱峰峰面积Table1 Peak areas of samples HPLC

图6　葡萄糖与纤维二糖含量Fig.6 Contents of glucose and cellobiose

由图6可知，0~1 d时葡萄糖含量呈下降趋势，这与堆肥过程中温度和β-葡萄糖苷水解酶有关，此时温度处于上升期，微生物活性较弱，一方面堆肥初始物料中葡萄糖作为微生物营养物质被利用，另一方面β-葡萄糖苷水解酶产生量极少或为零，无法将纤维二糖分解成葡萄糖分子，导致葡萄糖在堆体中含量逐渐下降。堆肥第4天葡萄糖含量出现第1个峰值（1.85mmol·kg-1），此时进入高温期前期，微生物代谢旺盛，产生β-葡萄糖苷水解酶分解代谢产生大量葡萄糖，但因为微生物旺盛代谢同样需大量营养物质供给，此时葡萄糖含量不会大量累积，在第4~7天呈下降趋势。高温期后期与降温腐熟期前期，由于微生物活动减弱，导致葡萄糖消耗量降低且上一时期葡萄糖逐步累积，导致从降温腐熟期第23天葡萄糖含量达到第2个峰值（5.35mmol·kg-1）。第23天后微生物主要以葡萄糖为营养物质大量消耗，使葡萄糖含量再次降低。

第0~4天，纤维二糖含量变化呈先升后降趋势，证明在这一阶段，堆体中产生纤维二糖，在略有累积时由于β-葡萄糖苷水解酶作用使纤维二糖分解，导致这一趋势产生。高温阶段后期和降温腐熟前期，纤维二糖含量一直处于较低水平，维持在0~0.91 mmol·kg-1，与此时β-葡萄糖苷水解酶较高活性相对应。堆肥第13天起，纤维二糖大量累积，第29天达到最大值（1.29mmol·kg-1）。

3　讨论

研究结果表明，温度作为基本和关键堆肥技术指标，影响微生物在堆肥过程中代谢活动强弱[20]。测定CMC酶、β-葡萄糖苷水解酶两种酶在堆肥各时期酶活性，与Cunha-Queda研究结果相符[9]，即在堆肥进程中，两种酶活性变化密切相关，活性在高温期处于较高活力范围内。由于堆肥过程中，各种酶主要来源为微生物次级代谢产物，在堆肥不同阶段，细菌、真菌和放线菌对温度适应能力不同导致种类和数量差别大，因此堆肥过程中活性与各时期微生物数量和种类密切相关。堆肥过程中酶活性与堆体中微生物关系试验发现，β-葡萄糖苷水解酶活性与真菌中霉菌属和放线菌数量显著相关，证明堆肥过程中堆体内霉菌和放线菌产生大量β-葡萄糖苷水解酶类次生代谢产物。堆肥第23天，堆体葡萄糖含量是所有样品中最高值，此时β-葡萄糖苷水解酶活性水平不高，导致此时纤维素降解缓慢，朱凤姝等研究表明葡萄糖对β-葡萄糖苷水解酶有反馈调节作用，葡萄糖累积会抑制β-葡萄糖苷水解酶产生[21]。因为β-葡萄糖苷水解酶在纤维素类有机物分解过程中作为限速酶具有重要作用，目前在堆肥碳循环研究中也利用β-葡萄糖苷水解酶活性判断堆肥腐熟程度。可见，在堆肥碳循环过程中β-葡萄糖苷水解酶起决定性作用[22]。在牛粪秸秆堆肥过程中，纤维素类有机物质降解主要是CMC酶和β-葡萄糖苷水解酶作用结果，因此纤维素类有机物质降解与相关产酶微生物种属、数量和产酶量存在一定关系，当微生物代谢活跃时，堆体中大量可被微生物降解利用的纤维素类有机物质存在可刺激微生物产生相应酶类。随堆肥过程推进，CMC酶与β-葡萄糖苷水解酶活性均呈先升后降趋势，与Goyal等研究结果相符[23]。

高温期是降解木质纤维素类物质主要阶段，纤维素和半纤维素相对含量与其他时期相比明显降低，木质素在这一时期相对含量也发生小幅变化，这与高温期CMC酶较高活性有关，也间接反映温度对微生物活性影响。在堆肥降温腐熟期，可明显观察到木质纤维素各成分相对含量趋于稳定，因堆肥体系中容易被微生物代谢分解的有机物质大部分在高温期已被利用，剩余一些难利用降解组分，再加上温度降低微生物活性下降，两种酶活性减弱，导致木质纤维素降解率降低。Goy⁃al等在对牛粪甘蔗残渣堆肥中发现，牛粪含量较多的体系中CMC酶活性明显高于牛粪含量较少体系中酶活性。这是由于牛粪中可降解纤维素类有机物明显多于甘蔗中纤维素类有机物质，促进堆体中微生物合成大量酶使纤维素类酶活性升高[23]。进入降温腐熟阶段后，由于纤维素类有机物质在高温期被大量分解利用，微生物代谢活动减弱，CMC酶活性下降，此时β-葡萄糖苷水解酶酶活力较弱，导致纤维二糖大量累积，纤维二糖对CMC酶有反馈抑制作用，CMC酶活性降低，与β-葡萄糖苷水解酶活性变化相似[24]。

4　结论

高温期CMC酶和β-葡萄糖苷水解酶两种酶活性最高，呈先升后降趋势。由于高温期CMC酶活性较高，纤维素和半纤维素在这一时期降解率最高，降温腐熟阶段，微生物活性伴随趋于平稳的堆体平均温度逐渐降低，CMC酶活性下降，导致纤维素和半纤维素降解变化较高温期不明显。整个堆肥过程中，木质素相对含量变化不明显，仅降温腐熟期小幅增加。高效液相色谱测得的葡萄糖和纤维二糖含量与CMC酶和β-葡萄糖苷水解酶活性及温度变化密切相关，高温期纤维素类物质降解率最高，在实际生产应用中，可适当延长高温期时间控制温度，加快纤维素类物质降解并促进堆体腐熟。

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Correlation study on cellulose activities and ligocellulose degradation

during composting/LI Hongtao,WANG Han,ZANG Xiangyun,LIU Meiting
(School of Resources and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

After the composting in the self-made composting bioreactor,the enzyme dynamics of CMCase andβ-glucosidase determined and the content of cellulose,hemicellulose and lignin in the compost pile were measured,in addition the content of glucose and cellobiose were determined using HPLC.The results showed that the temperature of the pile up to 45℃in the first 3 days of composting,the thermophilic phase started,the thermophilic phase lasted for 8 days.After the peaking temperature,the temperature of pile was approached to the background in the cooling phase.The activity ofβ-glucosidase reached the peak (1.482 μmol p-Nitr·g-1DW·min-1)on the 4th day and stabilized range from 0.429 to 0.533 μmol p-Nitr·g-1DW·min-1.The activity trend of CMCase was similar toβ-glucosidase,reached the peak of 47.67 μg glucose·g-1DW·min-1on the 7th day.The amounts of cellulose and hemicellulose were reduced during the thermophilic phase while the amount of lignin was increased slightly in the cooling phase.The results revealed that the degradation of the cellulose and hemicellulose was a positive correlation to the enzyme dynamics of CMCase.

composting;CMCase;β-glucosidase;high pressure liquid chromatography

S141.4

A

1005-9369（2016）06-0033-08

2016-03-18

国家自然科学基金项目（31300428）；黑龙江省自然科学基金项目（C2015005）；黑龙江省教育厅项目（12541009）；黑龙江省博士后科研启动基金项目（LBH-Q13017）

李洪涛（1978-），男，副教授，博士，研究方向为农业固体废弃物资源利用。E-mail：htl@neau.edu.cn