外源端粒酶逆转录酶基因对老年大鼠供肝缺血再灌注损伤的影响

王　鑫　王忠臣　黄智勇

(大庆龙南医院普外科，黑龙江　大庆　163000)



外源端粒酶逆转录酶基因对老年大鼠供肝缺血再灌注损伤的影响

王鑫王忠臣黄智勇

(大庆龙南医院普外科，黑龙江大庆163000)

目的探讨外源端粒酶逆转录酶基因对老年大鼠供肝缺血再灌注损伤的影响。方法SD大鼠分为端粒酶催化亚基(hTERT)干预组(n=25)、空转载体组(n=5)、生理盐水组(n=25)3组，取肝前2 d自颈背给予hTERT干预组供者静脉注射1 ml 3×109pfu/ml携带hTERT的病毒悬液，给予空转载体组供者静脉注射1 ml 3×109pfu/ml空病毒悬液，给予生理盐水组供者静脉注射1 ml生理盐水。结果再灌注后3、6、12 h，1、2 d hTERT组血清谷氨酸转氨酶(ALT)水平均显著低于空转载体组和生理盐水组(P<0.05)，凋亡阳性细胞均显著少于空转载体组和生理盐水组(P<0.05)，凋亡指数也均显著低于空转载体组和生理盐水组(P<0.05)；转染1 d后hTERT组肝细胞端粒酶活性显著高于阴性对照组和阳性对照组(P<0.05)。结论外源端粒酶逆转录酶基因能够有效防护老年大鼠供肝缺血再灌注损伤。

外源端粒酶逆转录酶基因；供肝缺血再灌注损伤

肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)的一个极为重要的表现就是细胞凋亡，组织产生的氧自由基在再灌注的情况下会对肝细胞进行诱导使其发生凋亡〔1〕。目前国内外研究的一个热点就是采取何种方法最大限度地降低缺血再灌注引发的移植肝细胞凋亡程度。现阶段，基因重组技术已经得到了应用，对Bcl-2、HO-1等进行构建表达，对凋亡基因的质粒进行抑制并向小动物肝移植供者体内导入，但是将目的基因设定为端粒酶的研究还没有出现〔2〕。本研究对肝移植缺血再灌注损伤中人端粒酶催化亚基(hTERT)基因的作用进行探讨。

1　材料与方法

1.1实验材料采用黑龙江省实验动物中心提供的SD大鼠，本实验室自行构建表达外源性hTERT的重组复制缺陷性腺病毒，经Pme I酶切线性化携带目的基因的质粒后向细菌中转入，并同源重组其和细菌中含腺病毒基因骨架的质粒AdEasy。经Pac I酶切重组质粒Ad-hTERT后对293细胞进行转染，包装成腺病毒颗粒，并大量扩增及纯化。同时将空载体病毒AdEasy质粒构建，扩增、氯化铯梯度离心后对病毒滴度进行测定，保存在-80℃的温度下备用。购买美国Allied Biotech Inc公司生产的端粒酶检测试剂盒和美国Boehinger Mannheim公司生产的TUNEL试剂盒。

1.2实验分组将SD大鼠分为hTERT干预组(n=25)、空转载体组(n=5)、生理盐水组(n=25)3组，取肝前2 d自颈背给予hTERT干预组供者静脉注射1 ml 3×109pfu/ml携带hTERT的病毒悬液，给予空转载体组供者静脉注射1 ml 3×109pfu/ml空病毒悬液，给予生理盐水组供者静脉注射1 ml生理盐水。在肝脏保存(UW)液中放置切取的供肝，进行6 h的修整保存后向同种大鼠移植。移植后3、6、12 h、1、2 d，分别取材对ALT、端粒酶活性等进行检测。

1.3实验方法①运用二袖套法建立大鼠肝移植模型；②抽取下腔静脉血，取上清液，采用全自动生化分析仪对谷氨酸转氨酶(ALT)含量进行测定；③将20 mg目的基因转染的供肝组织与20 mg对照组供肝组织取出，采用美国Allied Biotech Inc公司生产的Telomerase PCR ELISA试剂盒检测端粒酶活性，操作过程中严格依据试剂盒说明书进行；④免疫印迹法的操作步骤为：应用蛋白裂解液将肝组织裂解，-4℃离心将上清取出，上样电泳，转膜，封闭，将一抗、二抗加入其中，显色；⑤采用10%甲醛溶液将肝组织固定，HE染色前保证常规石蜡切片，然后在普通光镜及电镜下进行病理组织学观察；⑥将规格为0.5 cm×0.5 cm的大鼠肝组织取出，在4%多聚甲醛中放置，进行1 d的固定后常规石蜡包埋，切成切片，切片厚度为5 μm，操作过程中严格依据试剂盒说明书进行。阳性标准为细胞核被染成棕黄色，高倍视野(×400)下将每张切片的5个视野选取出来，为每个视野肝细胞总数计数，同时为阳性肝细胞计数。

1.4统计学方法采用软件SPSS20.0统计软件进行t检验。

2　结　果

2.1再灌注后血清ALT水平比较再灌注后3、6、12 h hTERT组血清ALT水平均显著低于空转载体组和生理盐水组(P<0.05)，但空转载体组和生理盐水组血清ALT水平差异均不显著(P>0.05)。见表1。

表1　各组再灌注后各时点血清ALT水平比较±s)

与空转载体组比较：1)P<0.05；与生理盐水组比较：2)P<0.05；下表同

2.2再灌注后肝细胞端粒酶活性比较转染1 d后hTERT组肝细胞端粒酶活性(32 500±500)显著高于阴性对照组(22 500±500)和阳性对照组(2 500±500)(P<0.05)。

2.3免疫印迹检测结果有显著hTERT蛋白阳性条带存在于hTERT组肝组织中，但是不存在于空转载体组和生理盐水组。见图1。

2.4移植肝脏组织学检查结果空转载体组和生理盐水组移植肝小梁结构均被严重破坏，有空泡样变性及水肿出现在门静脉周围，电镜检测也发现有大量空泡出现在肝细胞内，线粒体肿胀严重。见图2。

2.5肝细胞凋亡检查结果再灌注后3、6、12 h，1、2 d hTERT组凋亡阳性细胞均显著少于空转载体组和生理盐水组(P<0.05)，凋亡指数也均显著低于空转载体组和生理盐水组(P<0.05)，但空转载体组和生理盐水组凋亡阳性细胞和凋亡指数差异均不显著(P>0.05)，见表2、图3。

图1　各组肝组织中hTERT蛋白的表达情况

组别n3h6h12h1d2dhTERT组255.3±0.731)2)10.2±0.671)2)9.3±0.781)2)7.1±1.121)2)4.8±0.651)2)空转载体组57.8±1.0515.9±1.8211.7±1.598.3±1.096.4±0.67生理盐水组257.8±0.8315.9±1.5811.7±1.598.8±0.86.5±0.70

图2　移植肝脏组织学检查结果(×100)

图3　再灌注后hTERT组、生理盐水组肝细胞凋亡阳性细胞(×200)

3　讨　论

在临床病理及手术过程中，肝脏缺血再灌注损伤极易发生，其属于一个复杂的病理过程，参与主体为多细胞，多种介质共同将作用发挥出来。细胞凋亡即细胞死亡，诱发因素为生理性等因素，不引发炎症反应。很多疾病的发生过程均受到凋亡异常的直接影响。研究表明〔3〕，细胞凋亡和缺血再灌注损伤具有极为密切的关系，在HIRI的病理过程中，凋亡可能发挥着极为重要的作用。相关医学学者研究表明〔4〕，向大脑皮层转染缺陷型单纯疱疹病毒载体(载有抗凋亡基因bcl-2)后bcl-2基因表达显著，同时能够有效保护表达部位神经。现阶段，已有相关医学学者在对大鼠等bcl-2高表达的转基因动物进行建立的过程中将转基因技术充分利用，同时在缺血再灌注损伤的动物模型的建立过程中将该动物充分利用，研究结果显示和正常动物相比，该转基因动物具有显著较强的组织损伤程度〔5〕。研究证实〔6〕，衰老进程由端粒长度控制，对衰老进行触发的分子钟为端粒缩短。在大部分正常的人体细胞中并无法对端粒酶活性进行检测，随着细胞分裂，端粒会丢失，丢失频率为每次50～200个碱基。研究表明〔7〕，发生这一现象的原因为正常的人体细胞中端粒酶没有被活化。正常体细胞的增殖能力可能在保护性端粒酶的作用下受到了最终制约。细胞在几千个碱基的端粒DNA丢失后就会停止分裂而衰老，并最终引发细胞凋亡。如果体外给予适量端粒酶，则会对细胞凋亡进行有效防止，进而促进细胞增殖能力的显著增强。研究表明〔8〕，向正常的细胞中导入端粒酶基因会造成端粒酶表达异常。异常延长的活化端粒酶序列会在极大程度上增加细胞寿命。本研究结果提示外源端粒酶逆转录酶基因能够有效防护老年大鼠供肝缺血再灌注损伤。

1吴灵芝，李水彬，程刚卫，等.hTERT基因转染对人神经元活力的影响〔J〕.赣南医学院学报，2014；34(2)：170-3.

2靳斌，王伟，刘泽阳，等.外源hTERT基因转染对老年大鼠供肝缺血再灌注损伤的防护作用〔J〕.山东大学学报(医学版)，2013；51(8)：13-6.

3刘晓丽，马礼鸿，王凯.Bmi-1和hTERT在胃癌组织中的表达及临床病理意义〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(19)：4694-5.

4李金丫，左静，刘亮，等.食管癌高发区人群咬检组织中hTERT蛋白的表达及其临床意义〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(4)：713-4.

5Guo L，Li P，Meng CY，etal.Protective effect of zinc on mouse renal ischemia-reperfusion Injury by anti-apoptosis and antioxidation〔J〕.Curr Pharmac Biotechnol，2014；15(6)：577-82.

6Chahine N，Makhlouf H，Duca L，etal.Cardioprotective effect of saffron extracts against acute doxorubicin toxicity in isolated rabbit hearts submitted to ischemia-reperfusion injury〔J〕.Zeitschriftfür Naturforschung C，2015;69(9-10)：459-70.

7Alhejily W，Aleksi A，Martin BJ，etal.The effect of ischemia-reperfusion injury on measures of vascular function〔J〕.Clin Hemorheol Microcirc，2014L；56(3)：265-71.

8Zhu SH，Zhou LJ，Jiang H，etal.Protective effect of indomethacin in renal ischemia-reperfusion injury in mice〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2014；15(8)：735-42.

〔2015-02-19修回〕

(编辑苑云杰)

王鑫(1981-)，男，主治医师，主要从事普外科疾病研究。

R53.3

A

1005-9202(2016)15-3660-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.022