AKT-mTOR信号通路在大鼠椎间盘软骨终板细胞自然退变中的意义

张丽勇

(白城医学高等专科学校生理教研室，吉林　白城　137000)



AKT-mTOR信号通路在大鼠椎间盘软骨终板细胞自然退变中的意义

张丽勇

(白城医学高等专科学校生理教研室，吉林白城137000)

目的探讨AKT-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在大鼠椎间盘软骨终板细胞自然退变中的表达情况。方法取清洁级SD大鼠12只，分离并培养椎间盘软骨终板细胞，建立体外自然传代退变模型。随机分为空白对照组(自然传代第2代细胞)，自然退变组(自然传代第5代细胞)、AKT-mTOR信号通路抑制组(含LY294002抑制剂培养基传代至第5代)，AKT-mTOR信号通路激动组(含IGF-1激动剂培养基传代至第5代)。倒置显微镜下观察各组细胞形态；甲苯胺蓝染色检测细胞蛋白聚糖变化；RT-PCR检测细胞中Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9以及AKT-mTOR信号通路中关键基因mTOR的表达情况；Western印迹检测AKT、p-AKT蛋白表达情况。结果随着传代次数增加，大鼠软骨终板细胞的表现逐渐减少。自然退变组Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表达水平均明显低于空白对照组(P<0.05)，AKT-mTOR信号通路抑制组表达水平明显低于自然退变组(P<0.05)；AKT-mTOR信号通路激动组表达水平明显高于自然退变组(P<0.05)。四组的AKT蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)；抑制组p-AKT蛋白表达水平低于另外3组，而激动组p-AKT蛋白表达水平明显高于抑制组和自然退变组(P<0.05)。结论AKT-mTOR信号通路在大鼠椎间盘软骨终板细胞自然退变中具有重要作用，添加AKT-mTOR信号通路抑制剂、激动剂能够加速、抑制细胞体外退变的发生。

椎间盘退行性改变；软骨细胞；AKT/mTOR

椎间盘退变是脊柱退行性疾病发生的起因和病理基础。软骨终板是椎间盘主要供养途径，是维持椎间盘正常形态和生理功能的关键〔1〕。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的一种，其所处的信号通路包括上游的P13K、AKT、PTEN、TSC1/2，以及下游的SK6、4EBP。而信号通路中P13K、AKT突变可引发mTOR通路的高度激活〔2〕。相关研究显示，mTOR作为P13K相关激酶之一，在控制细胞生长周期方面具有重要作用〔3〕。本研究旨在探明AKT-mTOR信号通路与大鼠软骨终板细胞退变的关系。

1　材料与方法

1.1动物和试剂清洁级SD大鼠12只，4～5周龄，雌雄各半，体重140～180 g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供。胶原酶、胰蛋白酶(北京中生瑞泰科技有限公司)；LY294002 AKT信号通路抑制剂(美国SIGMA公司)；DMEM细胞培养液、胎牛血清(上海杰美基因医药科技有限公司)；PCR试剂盒及相关抗体(北京天根生化科技有限公司)；IGF-1 rat recombinant(上海浩然生物技术有限公司)；AKT、p-AKT(圣克鲁斯生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞分离、培养及分组断髓处死12只大鼠，75%乙醇溶液中浸泡20 min，无菌操作台内取完整腰椎，逐个剥离大鼠腰椎间盘1～5段终板软骨，胰蛋白酶消化分离软骨终板细胞。当细胞单层融合度85%～90%时开始细胞传代，传至第2代后终止，2×105个/孔接种到6孔细胞培养板中，连续培养2～3 d。其中第2代细胞为空白对照组；第2～5代细胞为自然传代组；细胞传代过程中添加30 μmol/ml的含LY294002 AKT信号通路抑制剂的细胞培养液，传代至第5代为AKT-mTOR信号通路抑制组；细胞传代过程中添加20 ng/ml的含IGF-1 AKT信号通路激动剂的细胞培养液，传代至第5代为AKT-mTOR信号通路激动组。

1.2.2甲苯胺蓝染色各组中细胞融合约80%时进行甲苯胺蓝染色：除去细胞培养液后用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3～4次，4%多聚甲醛固定45 min后除去固定液，用PBS冲3～4次，甲苯胺蓝染色60 min，PBS洗净后放于倒置显微镜下观察、拍照。

1.2.3RT-PCR检测使用Trizol抽提各组软骨终板细胞的RNA，Agilent 2100 bioanalyzer检测提取RNA的纯度，取1 μg总RNA，一步法反转录合成cDNA。RT-PCR扩增体系为10 μl(SYBRR染料预混的extaq 酶5 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，cDNA模板4 μl)，引物合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。混匀后常规反应条件下置于RT-PCR仪中反应。

1.2.4Western印迹检测吸除6孔细胞培养板中的培养液，PBS冲3～4次，每孔加入100 μl含PMSF的蛋白裂解液，冰袋上裂解40 min，4℃ 12 000 r/min离心20 min，吸取上清液至无菌EP管中，BCA法测定提取得到的蛋白质浓度。每组取蛋白质样品20 μg，行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜120 min。5% BSA封闭60～120 min，加一抗(1∶1 000)，4℃过夜，TBST冲洗3次，加二抗(1∶5 000)，温室孵育3 h，TBST冲洗3次。红外荧光扫描成像系统扫描并收集数据，GAPDH为内参。

1.3统计学分析使用SPSS15.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1大鼠软骨终板表型变化随着传代次数增加，大鼠软骨终板细胞逐渐表现出梭形变化，出现多角形和触角，第2～5代呈现出纤维化趋势，见图A1～A4。大鼠软骨终板细胞甲苯胺蓝染色显示，第2～5代染色逐渐变深、深染，见图B1～B4。空白对照组、自然退变组和第5代激动剂组的软骨终板细胞形态、甲苯胺蓝染色显示：第5代激动剂组细胞形态和染色与自然退变组相比恢复明显，但未恢复到空白对照组形态，见图2。

A1～A4为自然传代第2～5代细胞形态；B1～B4为自然传代第2～5代甲苯胺蓝染色图1　大鼠软骨终板细胞形态和甲苯胺蓝染色(×100)

图2　自然传代第2代、自然传代第5代、第5代激动剂组细胞形态和甲苯胺蓝染色(×100)

2.2大鼠软骨终板相关基因RT-PCR检测自然传代组中：第2～5代大鼠中Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表达明显降低；抑制组的表达明显低于自然传代组(P<0.05)；激动剂组表达明显高于自然传代组(P<0.05)。

2.3大鼠软骨终板细胞中AKT及p-AKT表达变化Western印迹检测显示，空白对照组、自然退变组、AKT-mTOR信号通路抑制组和激动组的AKT蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。抑制组p-AKT蛋白表达水平低于另外3组，而激动组p-AKT蛋白表达水平明显高于抑制组和自然退变组(P<0.05)，见图3。

图3　Western印迹检测大鼠软骨终板细胞的AKT水平

3　讨　论

PI3K-AKT-mTOR信号通路在哺乳动物细胞内广泛存在，可影响细胞的增殖、分化PI3K是一种分布于细胞质中的复合体，作为脂类激酶能够催化磷脂酰肌醇D3位的酸化，进而调控细胞的整个周期以及能量转运等〔4〕。相关研究显示，胰岛素样生长因子、表皮样生长因子等多种信号传导复合体和生长因子均可启动PI3K-AKT信号通路的激活过程〔5〕。而PI3K-AKT信号通路在细胞增殖、分化、代谢中发挥重要作用。人类和鼠类在mTOR结构的氨基酸分子水平上的同源性高达95%〔6〕，mTOR不仅有控制基因翻译、参与DNA/RNA合成、影响蛋白质降解等生理过程，最新研究还发现其与哺乳动物生理性衰老及肿瘤发生具有明显关联〔7〕。mTOR信号通路不仅是细胞正常生长周期的调控中心，还是PI3K-AKT信号通路控制细胞自噬的关键调节点。mTOR位于PI3K-AKT信号通路的下游，能够调控翻译过程中的启动及延伸、氨基酸转运、机体代谢相关蛋白酶的转录、核糖体合成。

相关研究显示，AKT-mTOR信号通路与人体一系列退行性病变存在明显相关性〔8〕。LY294002是目前常用的AKT-mTOR信号通路抑制剂，能够抑制该通路的磷酸化而使其丧失活性，影响下游mTOR信号，进而抑制细胞分化、增殖，诱导细胞凋亡。IGF-1是目前常用的AKT-mTOR信号通路激动剂，能够明显加快关节软骨细胞的增殖、分化，以及软骨基质合成，能够有效削弱LY294002对细胞的抑制效果。本研究结果显示，AKT-mTOR信号通路在大鼠椎间盘软骨终板细胞体外自然退变过程中起到重要作用，在软骨终板细胞传代过程中调控AKT-mTOR信号通路可有效加速、缓解甚至抑制大鼠椎间盘软骨终板细胞的生理性退变。本次实验结果为抑制腰椎间盘生理性退变提供了一个全新思路和靶点，可以此为基础研发相关治疗药物。

1钟小明，胡侦明，沈皆亮，等.白藜芦醇干预对已退变椎间盘终板软骨细胞SIRT1表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(6)：1304-7.

2Wang K，Chen YP，Lei Y，etal.Electrochemical method for monitoring the progress of polymerase chain reactions using Methylene blue as an indicator〔J〕.Mikrochimica Acta，2013；180(9/10)：871-8.

3Urquiza MP，Acatzi Silva AI.Copy number ratios determined by two digital polymerase chain reaction systems in genetically modified grains〔J〕.Metrologia，2014；51(1)：61-6.

4徐宏光，彭红心，程加峰，等.人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型的建立及其意义〔J〕.中华医学杂志，2011；91(41)：2912-6.

5Wang C，Zhou H，Zhu W，etal.Ultrasensitive electrochemical DNA detection based on dual amplification of circular strand-displacement polymerase reaction and hybridization chain reaction〔J〕.Biosensors Bioelectronics，2013；47：324-8.

6Deng M，Wang Y，Li J,etal.N-Methylimidazolium modified magnetic particles-assisted highly sensitive Escherichia coli detection based on polymerase chain reaction and capillary electrophoresis〔J〕.Anal Chim Acta，2014；827：47-53.

7钟小明.白藜芦醇通过SIRT1/IGF-1R/AKT通路促进退变椎间盘终板软骨细胞合成细胞外基质〔D〕.重庆：重庆医科大学，2012.

8王飞.腰椎间盘退变中软骨终板细胞的凋亡及CTGF对其保护作用的实验研究〔D〕.广州：南方医科大学，2010.

〔2016-02-15修回〕

(编辑滕欣航)

吉林省教育厅“十二五”项目(20140129)

张丽勇(1974-)，女，硕士，副教授，主要从事临床生理学研究。

R68

A

1005-9202(2016)15-3651-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.018