血压的性别差异与小鼠肾脏钠离子通道的关系

王伟，俞国峰，程梦婷，赵蓉，刘珍

(温州医科大学，检验医学院生命科学学院，浙江省遗传学重点实验室，浙江 温州　325035)



血压的性别差异与小鼠肾脏钠离子通道的关系

王伟，俞国峰，程梦婷，赵蓉，刘珍*

(温州医科大学，检验医学院生命科学学院，浙江省遗传学重点实验室，浙江 温州325035)

目的研究雌雄小鼠的血压、肾脏尿钠排泄以及相关的肾脏钠离子通道和信号通路，初步探讨血压的性别差异与肾脏钠离子通道的关系。方法选取成年雌雄小鼠，用无创血压仪检测小鼠血压，火焰分光光度计测量小鼠血、尿钠离子浓度，Real-time PCR和Western-Blot检测小鼠肾脏钠氯同向转运体(NCC)、钠钾氯同向转运体(NKCC2)、上皮钠离子通道(ENaC)的表达水平，以及上游的缺乏赖氨酸的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(WNK激酶)的mRNA水平。 结果雌鼠血压低于雄鼠，尿钠排泄高于雄鼠，NCC、NKCC2的mRNA和蛋白水平均明显增加，ENaC无明显差异，WNK4显著升高，WNK1无差异。结论雌鼠血压低于雄鼠可能是由雌鼠尿钠排泄增加导致，WNK4-NCC/NKCC2信号通路参与其调控。

性别；血压；钠离子通道；WNK；小鼠

血压存在两性差异，女性在绝经前的血压和高血压的患病率均低于男性，其具体机制尚未完全阐明[1,2]。血压的调控受多种因素影响[3]，其中肾脏起着至关重要的作用[4,5]。已有报道，肾脏主要通过肾素血管紧张素醛固酮(RAAS)系统[6]调节离子转运[7]以维持血压平衡。大量的研究表明，性别与RAAS系统密切相关[8-12]。其中肾脏中参与血压调节的钠离子转运蛋白有钠氯同向转运体(NCC)，钠钾氯同向转运体(NKCC2)以及上皮钠离子通道(ENaC)等[13]。

近来研究发现，NCC/NKCC2受WNK- SPAK/OSR1-NCC/NKCC2信号通路的调节[14-16]。WNK激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶家族新成员，自2001年耶鲁大学首次提出WNK突变会导致一种新型的家族性高血钾高血压(FHHt)后，WNK激酶对肾脏离子通道影响的研究成为热点。

本研究通过分析雌、雄小鼠的血压、肾脏钠离子通道以及WNK信号通路的异同，以期发现它们之间的关联，初步探讨血压的性别差异与肾脏钠离子通道的关系。

1　材料和方法

1.1实验动物

20～24周龄的SPF级C57BL/6J雌、雄小鼠各10只，体重20～25 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2012-0002]。动物实验均于温州医科大学实验动物中心[SYXK(浙)2015-0009]进行，实验中涉及的动物操作均遵守实验动物使用的3R原则。

1.2主要仪器及试剂

仪器：小鼠代谢笼购自北京佳源兴业科技有限公司；小鼠无创血压计(BP-98A)购自日本Softron公司；火焰分光光度计(PFP7)购自英国JENWAY公司；蛋白电泳仪(Bio-Rad 通用蛋白电泳及转膜系统)；蛋白印迹成像系统(Bio-Rad Chemi Doc MP)；Real-time PCR System(Bio-Rad：CFX96系统)。

试剂：TRIzol©RNA分离试剂购自Life Technologies；反转录试剂盒(Takara)；荧光定量试剂盒SYBR(Bio-Rad)；蛋白浓度定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific)。

抗体：兔抗鼠NCC (Stress Marq)；兔抗鼠NKCC2 (Stress Marq)；兔抗鼠WNK4 (Alpha Diagnostic)；兔抗鼠ENaC (Alonmone)；兔抗鼠β-actin (Beyotime)。

1.3血压的测量

采用尾套法测量小鼠尾动脉血压。小鼠在训练3 d后每天固定时间测量至少20个循环，持续测量5～7 d的血压。

1.4血钠与尿钠的检测分析

血钠：小鼠麻醉后眼眶静脉取血，低速离心取上清，用火焰光度计检测血清钠水平。

尿钠：小鼠置于代谢笼，期间供给常规饲料和自由饮水，待其稳定后收集尿样，用火焰光度计检测尿钠离子浓度。

1.5肾脏相关蛋白分子的检测

1.5.1转录水平—Real-time PCR

小鼠麻醉后取肾脏，按照TRIzol试剂盒操作说明裂解分离提取总RNA，经反转录后得到cDNA，按照Real-time PCR仪器操作要求进行荧光定量分析。其中所用的引物序列如下：

Renin (F:5’-ATGAAGGGGGTGTCTGTG-3’;R:5’-ATGTCGGGGGAGGGTGGGC-3’);

NCC (F:5’-GGGTTTGTGTCATGAGGAT-3’;R:5’-AGATGGTGCTAGCCTGCT-3’);

NKCC2 (F:5’-CCAGAGCGTTGTCTAAAGC-3’;R:5’-TGGGCAGCTGTCATCACTTA-3’);

WNK4 (F:5’-GCGGAGGAGGTGGCT-3’;R:5’-GCCACTGGCTGGTAGTCA-3’);

WNK1 (F:5’-GTCTGGACACCGAAACCAC-3’;R:5’-AGAAACTACTAGTAGTAGCAAAATCCT-3’);

Cyclophilin (F:5’-CGTGGCTCCGTTGTCTT-3;R:5’-TGACTTTAGGTCCCTTCTTCT-3’)。

1.5.2蛋白水平—Western-blot

小鼠麻醉后取肾脏，裂解提取总蛋白，经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜。一抗均为兔抗鼠单克隆抗体，稀释度为1:2000。为避免免疫印迹不同标本蛋白量不同造成的影响，免疫印迹结果用β-actin进行矫正。二抗均为山羊抗兔单克隆抗体，稀释度为1:4000。

1.6数据统计分析

2　结果

2.1血压和钠代谢

基础状态下，雌鼠血压明显低于雄鼠(F:117.6±0.54 vs M:110.0±0.67 mmHg,P< 0.05，图1A)，伴随雌鼠肾素mRNA水平升高50%(图1B)。虽然雌、雄小鼠血钠水平无明显差异(图1C)，但雌鼠尿钠排泄明显高于雄鼠(F:514.30±23.1 vs M:365.0±27.2 μmol/24 h，P< 0.05，图1D)。这提示雌鼠血压低于雄鼠可能是由雌鼠尿钠排泄增加导致。

注: *P < 0.05；NSP>0.05，与雄鼠相比。图1　雌雄小鼠的血压、肾素、血钠和尿钠的分析Note. *P < 0.05；NSP>0.05，compared with M group.Fig.1　Analysis of blood pressure, renin, plasma sodium level and urinary sodium excretion in male and female mice

2.2肾脏钠离子通道蛋白

在肾脏钠分泌中起重要调控作用的钠离子通道蛋白主要有远曲小管的钠氯共转运体(NCC)、髓袢升支粗段的钠钾氯共转运体(NKCC2)和皮质集合管处的上皮钠离子通道蛋白(ENaC)。为研究雌、雄小鼠血压与肾脏钠离子通道的关系，我们检测了上述通道的mRNA和蛋白水平表达量。

2.2.1NCC(sodium chloride cotransporter)钠氯同向转运体

如图2A所示，Western-blot结果显示，与雄鼠相比，雌鼠NCC 蛋白表达量增加约80%，Real-time PCR显示雌鼠NCC的mRNA水平比雄鼠增加70%(图2B)。

2.2.2钠钾氯共转运体(Na-K-2Cl cotransporter-2, NKCC2)

如图3A 的Western-blot结果显示：相对于雄鼠，雌性小鼠NKCC2 蛋白表达量升高一倍。Real-time PCR显示雌鼠NKCC2的mRNA水平高于雄鼠约60%(图3B)。

2.2.3ENaC-β(epithelial sodium channel)上皮钠离子通道蛋白

雌、雄小鼠ENaC转录水平和翻译水平表达差异无统计学意义(图4A、4B)。

注：(A)蛋白印迹分析;(B)实时荧光定量分析;*P < 0.05，与雄鼠相比。图2　雌雄小鼠肾脏NCC的表达Note. A: Western-blot ; B: Real-time PCR analysis；*P < 0.05，compared with M group.Fig.2　The expression of NCC in male and female mice

注：(A)蛋白印迹分析; (B)实时荧光定量分析;*P < 0.05，与雄鼠相比。图3　雌雄小鼠肾脏NKCC2的表达Note.(A)Western-blot ; (B)Real-time PCR analysis；*P < 0.05，compared with M group.Fig.3　The expression of NKCC2 in male and female mice

注：(A)蛋白印迹分析; (B)实时荧光定量分析; NSP > 0.05，与雄鼠相比。图4　雌雄小鼠肾脏ENaC-β的表达Note.(A)Western-blot ; (B)Real-time PCR analysis；NSP > 0.05，compared with M group.Fig.4　The expression of ENaC-β in male and female mice

2.3WNK激酶

通过检测WNK 激酶家族中的WNK1和WNK4，发现雌鼠肾脏WNK4 转录水平高于雄鼠约50%(图5A)，而WNK1在雌、雄小鼠之间无显著差异(图5B)。

注: *P < 0.05；NSP > 0.05，与雄鼠相比。图5　实时荧光定量分析WNK4和WNK1 的mRNA水平Note. *P < 0.05；NSP > 0.05，compared with M group.Fig.5　Real-time PCR analysis of WNK4 and WNK1 mRNA expression

3　讨论

大量研究表明，血压存在着一定的性别差异，已发现与同龄男性相比，绝经前女性的血压较低，但具体机制尚未阐明。我们发现雌鼠的血压低于雄鼠，虽然之前Swasti Tiwari[17]报道雌、雄小鼠血压差别不明显，可能是小鼠的背景不同，或是血压测量方法不同导致。肾素-血管紧张素-醛固酮系统可维持血压的平衡，我们的结果显示，雌鼠肾素水平高于雄鼠，可能是血压低导致的反馈性上升。

血压的调控受多方面影响，其中肾脏钠离子的重吸收对维持血压的稳定起着重要调控作用。我们的研究发现，雌鼠尿钠排泄升高，这可能是导致雌鼠血压下降的一个重要因素。尿钠的排泄增加一般会伴随着肾脏钠离子转运通道的下降，但是我们的研究表明，NCC、NKCC2的表达量上升，这和雌鼠血压下降、排钠增多的结果相悖，其具体机制未知，可能是钠排泄增加导致的NCC、NKCC2代偿性上升[18-23]。

已有研究表明，WNK激酶与SPAK/OSR1形成的信号通路对NCC &NKCC2 起着重要的调控作用，Rojas-Vega[24]报道，雌鼠的SPAK/OSR1明显高于雄鼠，我们的结果显示，雌鼠WNK4的表达量明显高于雄鼠,WNK1无统计学意义，提示WNK4-SPAK /OSR1-NCC/NKCC2信号通路可能参与雌雄小鼠血压差异的调控。

综上所述，不同性别小鼠之间存在血压差异，这一差异与肾脏的钠离子转运通道 NCC /NKCC2 以及WNK4激酶信号通路密切相关，其具体机制尚待进一步研究[25-27]。

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Relationship between gender difference of blood pressure and sodium ion channels in the kidney of mice

WANG Wei, YU Guo-feng, CHENG Meng-ting, ZHAO Rong, LIU Zhen*

(Wenzhou Medical University,School of Laboratory Medicine and Life Science,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical,Wenzhou 325035,China)

ObjectiveStudy on the blood pressure, renal sodium excretion, related renal sodium ion channels and signaling pathways between male and female mice, to investigate the relationship between gender differences in blood pressure and renal sodium ion channel.MethodsBlood pressure of adult female and male mice was measured using tail-cuff sphygmomanometer. Plasma and urine electrolytes were performed using flame photometer.Protein levels of renal sodium transporters NCC, NKCC2, ENaC were determined by western blot, mRNA levels of these transporters and the upstream With No lysine (WNK) kinases were determined by Real-time PCR.ResultsThe blood pressure of female mice was significantly lower than that of male mice. Renal sodium excretion and mRNA levels of NCC&NKCC2 were increased significantly in female mice. No obvious difference was observed in ENaC. The mRNA level of WNK4 was increased while no change in WNK1.ConclusionsThe lower blood pressure of female mice may caused by increasing renal sodium excretion and WNK4-NCC/NKCC2 signaling pathway involved.

Gender; Blood pressure; Sodium ion channels; WNK; Mice

国家自然科学基金(81300709)；浙江省自然科学基金(LY13H070007)。

王伟(1986-)，男，研究生，专业：生物学。E-mail: aster2103@126.com。

刘珍(1975-)，女，教授，研究生导师，研究方向：肾脏生理学。E-mail: zhenliuus@163.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0013-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.003

2016-03-30