新型Bluco类β-内酰胺酶分子探针的合成

钟　铮, 密　霞, 冯卫生, 孙德梅*, 甘海峰

(1. 河南中医药大学 药学院，河南 郑州　450046； 2. 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京　211800)



新型Bluco类β-内酰胺酶分子探针的合成

钟铮1, 密霞1, 冯卫生1, 孙德梅1*, 甘海峰2

(1. 河南中医药大学 药学院，河南 郑州450046； 2. 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京211800)

以2-氰基-6-羟基苯并噻唑为原料,与溴乙醛缩二乙醇缩合制得缩醛后再水解合成中间体6-(2-羰乙基)苯并[d]噻唑-2-甲腈(2)； 7-苯乙酰氨基-3-氯甲基头孢菌烷酸二苯甲酯依次经碘代和Wittig反应得(Z)-3-[3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-氧)丙-1-烯]-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸二苯甲酯(5); 5经脱保护、缩合和氧化反应合成了3个新的Bluco类似物,其结构经1H NMR，13C NMR和HR-MS(ESI)表征。

2-氰基-6-羟基苯并噻唑;β-内酰胺酶； 分子探针； Bluco类似物； 合成

报告基因技术广泛应用于监测细胞内的信号转导和基因表达[1-3]。近年来发展的TEM-1型β-内酰胺酶[4-6](β-lactamase)报告基因技术可以用于监测和示踪活细胞和体内的生物过程。小分子Bluco是用来检测β-内酰胺酶表达的一类新型生物荧光分子探针。该分子在细胞内先被β-内酰胺酶水解生成D-Luciferin, 而D-Luciferin可被氧化产生生物荧光而被检测到，从而达到检测β-内酰胺酶活性的目的[7]。

为改善Bluco在体内的稳定性，本文以2-氰基-6-羟基苯并噻唑(1)为原料,与溴乙醛缩二乙醇缩合制得缩醛后再水解合成中间体6-(2-羰乙基)苯并[d]噻唑-2-甲腈(2)； 7-苯乙酰氨基-3-氯甲基头孢菌烷酸二苯甲酯(3)依次经碘代和Wittig反应得(Z)-3-[3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-氧)丙-1-烯]-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸二苯甲酯(5)； 5经脱保护、缩合和氧化反应合成了3个新的Bluco类似物——3-【(Z)-3- {2-[(S)-4-羧基-4,5-二氢噻唑-2-基]苯并[d]噻唑-6-氧}丙-1-烯】-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(Bluco-S)， 3-【(Z)-3- {2-[(S)-4-羧基-4,5-二氢噻唑-2-基]苯并[d]噻唑-6-氧}丙-1-烯】-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-亚砜-1-氮双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(Bluco-SO1)和3-【(Z)-3- {2-[(S)-4-羧基-4,5-二氢噻唑-2-基]苯并[d]噻唑-6-氧}丙-1-烯】-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-砜-1-氮双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(Bluco-SO2)，其结构经1H NMR，13C NMR和HR-MS(ESI)表征。

Chart 1

Scheme 1

1　实验部分

1.1仪器与试剂

TEMP-MELT型熔点仪(温度未校正)；Bruker AMX-400型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；HP5989A型质谱仪。

1(98%), 上海凌凯医药科技有限公司； 3参照文献[7]制备；溴乙醛缩二乙醇(95%), 国药集团化学试剂有限公司; 其余所用试剂均为化学纯或分析纯。

1.2合成

(1) 2的合成

在50 mL单口瓶中加入1 1.10 g(6.24 mmol),溴乙醛缩二乙醇4.94 g(24.2 mmol), K2CO31.04 g(7.53 mmol)和DMF 22 mL，搅拌下于110 ℃反应4 h。冷却至室温，加入乙酸乙酯120 mL 稀释，依次用1 mol·L-1NaOH溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩得黄色油状液体。将全部黄色油状液体,对甲苯磺酸0.12 g(0.62 mmol)及乙醇30 mL加入到50 mL单口瓶中，室温下反应8 h。反应液用150 mL二氯甲烷稀释，依次用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后真空浓缩，经硅胶柱层析[洗脱剂:A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=5 ∶1] 纯化得白色固体2 0.62 g，收率45.6%;1H NMRδ：9.90(s, 1H), 8.15(d,J=8.6 Hz, 1H), 7.33～7.27(m, 2H), 4.72(s, 2H); MS(ESI)m/z: 219.1{[M+H]+} 。

(2) 4的合成

在100 mL单口瓶中加入3 2.66 g(5 mmol)、NaI 3.75 g(25 mmol)和无水丙酮30 mL，搅拌下于室温反应1 h。浓缩，残留物倒入水中，用乙酸乙酯萃取，有机相依次用10% Na2S2O3溶液(25 mL)、水、饱和食盐水洗涤, 无水硫酸镁干燥，浓缩至体积约35 mL，加入三苯基膦1.57 g(6 mmol)，于室温反应过夜。抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，干燥得季鏻盐4 3.10 g，收率71.1%(直接用于下一步反应)。

(3) 5的合成

在250 mL单口瓶中加入4 3.00 g(3.38 mmol)，二氯甲烷90 mL及1 mol·L-1NaOH溶液30 mL，搅拌下于室温反应40 min，分液。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液加入2 0.49 g(2.25 mmol)，于室温反应过夜。反应液浓缩得粗品，经硅胶柱层析(洗脱剂：A=5 ∶1)纯化得5 0.81 g ，收率52.6%；1H NMRδ： 7.99(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.42～7.26(m, 15H), 7.06(d,J=8.7 Hz, 2H), 6.92(s, 1H), 6.30(d,J=11.4 Hz, 1H), 6.01(d,J=9.0 Hz, 1H), 5.88(dd,J=4.8 Hz, 9.0 Hz, 1H), 5.77～5.69(m, 1H), 4.99(d,J=4.8 Hz, 1H), 4.39(dd,J=7.1 Hz, 12.8 Hz, 1H), 4.09(dd,J=4.8 Hz, 12.8 Hz, 1H), 3.66(s, 2H), 3.51～3.24(m, 2H); MS(ESI)m/z: 685.1{[M + H]+} 。

(4) (Z)-3-[3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-氧)丙-1-烯]-8-羰基-7-(2-苯乙酰氨基)-5-噻-1-氮双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(6)的合成

在50 mL单口瓶中加入5 0.10 g (0.14 mol)和二氯甲烷13 mL，搅拌下于0 ℃下加入茴香醚0.22 mL和TFA 0.55 mL，加毕，于室温反应4 h。反应液浓缩，残留物用乙醚洗涤后干燥得白色固体6 0.056 g，收率77.5 %；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ：13.65(br s, 1H) , 9.16(d,J=8.4 Hz, 1H), 8.16(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.85(dd,J=2.4 Hz, 9.0 Hz, 1H), 7.34(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.30～7.21(m, 5H), 6.51(d,J=8.7 Hz, 1H), 5.88～5.80(m, 1H), 5.70(dd,J=4.8 Hz, 8.1 Hz, 1H), 5.16(d,J=4.8 Hz, 1H), 4.87～4.68(m, 2H), 3.79～3.61(m, 2H), 3.56～3.47(m, 2H)； MS(ESI)m/z: 519.2{[M + H]+} 。

(5) Bluco-S的合成

在10 mL单口瓶中加入6 120 mg(0.22 mmol)、DMF 4 mL及水1 mL，加入D-Cysteine·HCl·H2O 96 mg(0.54 mmol)、碳酸氢钠69 mg(0.82 mmol)，搅拌下于室温反应40 min。过滤，滤液用1 mol·L-1盐酸调至pH 1，过滤，固体用DMF 1 mL溶解，滴入乙醚20 mL，滴毕(析出固体)，过滤，滤饼干燥得Bluco-S 120 mg，收率85%；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ： 13.60～13.16(m, 2H), 9.15(d,J=8.1 Hz, 1H), 8.06(d,J=9.3 Hz, 1H), 7.96(s, 1H), 7.72(s, 1H), 7.37～7.19(m, 6H), 6.50(d,J=12.3 Hz, 1H), 5.87～5.68(m, 2H), 5.43(t,J=8.9 Hz, 1H), 5.17(t,J=4.8 Hz, 1H), 4.84～4.68(m, 2H), 3.82～3.48(m, 5H);13C NMRδ： 174.6, 170.1, 165.5, 163.3, 161.9, 155.9, 154.2, 143.2, 136.8, 134.9, 133.7, 132.1, 128.4, 128.3, 126.5, 126.3, 122.1, 120.6, 112.1, 103.4, 78.7, 65.6, 56.8, 55.2, 38.7, 33.1, 26.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C29H25N4O7S3{[M + H]+} 637.088 5, found 637.089 2。

(6) Bluco-SO1的合成

在单口瓶中加入Bluco-S 89 mg(0.14 mmol)和二氯甲烷4 mL，搅拌下0 ℃滴加m-CPBA 55 mg (0.22 mmol)的二氯甲烷(4 mL)溶液，滴毕，继续反应0.5 h。反应液用二氯甲烷(60 mL)稀释，依次用10% Na2S2O3溶液和饱和食盐水洗涤, 无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得粗品，经硅胶柱层析[洗脱剂:B=V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)= 30 ∶1～10 ∶1]纯化得Bluco-SO172 mg。

用类似方法合成Bluco-SO2128 mg。

Bluco-SO1： 收率78.8%;1H NMRδ： 13.80～13.20(m, 2H)， 8.49(d,J=8.4 Hz, 1H), 8.06(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.95(s, 1H), 7.69(s, 1H), 7.31～7.19(m, 6H), 6.52(d,J=12.0 Hz, 1H), 5.89～5.79(m, 2H), 5.43(t,J=9.0 Hz, 1H), 4.93(d,J=4.2 Hz, 1H), 4.86～4.67(m, 2H), 3.99(d,J=18.0 Hz, 1H), 3.82～3.52(m, 5H);13C NMRδ： 174.5, 170.1, 165.7, 163.3, 161.9, 155.9, 154.2, 143.2, 136.8, 134.9, 133.7, 132.1, 128.4, 128.3, 126.5, 126.3, 122.1, 120.6, 112.1, 103.4, 78.7, 65.8, 65.6, 61.1, 41.7, 38.7, 3.2; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C29H25N4O8S3{[M+H]+} 653.083 5, found 653.084 4。

Bluco-SO2： 收率约92.2 %;1H NMRδ: 13.85(br s, 1H), 13.25(br s, 1H), 8.95(s, 1H), 8.06(s, 1H), 7.96(s, 1H), 7.71(s, 1H), 7.59～7.19(m, 6H), 6.42(s, 1H), 5.94～5.82(m, 2H), 5.41(d,J=9.3 Hz, 2H), 4.88～4.73(m, 2H), 4.44～4.26(m, 2H), 3.81～3.60(m, 3H);13C NMRδ： 174.6, 170.1, 165.7, 163.3, 161.9, 155.9, 154.2, 143.2, 136.8, 134.9, 133.7, 132.1, 128.4, 128.3, 126.5, 126.3, 122.1, 120.6, 112.1, 103.4, 78.7, 77.6, 65.2, 55.1, 50.2, 38.7, 33.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C29H25N4O9S3{[M+H]+} 669.078 4, found 669.078 9。

2　结果与讨论

2.12的合成

在2的合成中，使用缩醛保护的溴乙醛作烷基化试剂，避免了醛基被空气氧化；当碱为NaOH和NaH时均不反应，而碳酸钾能取得较好收率(两步合并收率45.6%)，可能是氰基对强碱不稳定所致；使用DMF作溶剂效果优于乙腈和丙酮。

2.25的合成

在5的合成中，用甲醇钠和NaH作碱, 收率均非常低，原因可能是二苯甲基对强碱不稳定。改用1 mol·L-1的 NaOH溶液后顺利完成反应。

2.3Bluco-S的合成

在Bluco-S的合成中，室温条件下在DMF-H2O中反应能够很快发生，收率最高达到85%；而升温至60 ℃时副产物明显增加；0 ℃时则反应时间明显延长，水解副产物增加，收率降低。使用乙醇为溶剂在室温下反应，有新的副产物出现，可能是乙醇在碱性条件下亲核性较强与氰基反应，收率降低。

2.4Bluco-SO1和Bluco-SO2的合成

控制间氯过氧苯甲酸的用量和反应时间可以选择性地合成Bluco-SO1或Bluco-SO2。通过对氧化剂用量的优化比较(1.4 eq., 1.5 eq., 1.6 eq., 1.7 eq.)，发现0 ℃条件下，1.6 eq.的氧化剂在0.5 h时原料Bluco-S能恰好完全转化，产物Bluco-SO1收率最高，而过度氧化物砜最少。将间氯过氧苯甲酸用量增大至2.3 eq.，同时延长反应时间，得到充分氧化物砜Bluco-SO2。

3　结论

为改善β-内酰胺酶分子探针Bluco在体内的生物稳定性，本文合成了三个Bluco类新化合物。该合成路线条件温和，操作简单、收率高，为β-内酰胺酶检测分子探针研究及Bluco化合物的合成提供了重要参考。

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Synthesis of Newβ-Lactamase Molecular Probe Bluco Analogues

ZHONG Zheng1,MI Xia1,FENG Wei-sheng1,SUN De-mei1*,GAN Hai-feng2

(1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;2. School of bio & pharma engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211800, China)

6-(2-Oxoethoxy)benzo[d]thiazole-2-carbonitrile(2)was prepared by condensation of 2-cyano-6-hydroxy benzothiazole(1) and 2-bromo-1,1-diethoxyethane and then hydrolytic reaction. (6R,7R,Z)-benzhydryl 7-benzamido-3-[3-(2-cyanobenzo[d]thiazol-6-yloxy)prop-1-enyl]-8-oxo-5-thia-1-aza-bicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate(5) was synthesized by iodination and Wittig reaction from(6R,7R)-benzhydryl 7-benzamido-3-(chloromethyl)-8-oxo-5-thia-1-aza-bicyclo [4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate. Three novel analogues of Bluco were synthesized by deprotection, condensation and oxidation reactions from 5. The structures were characterized by1H NMR，13C NMR and HR-MS(ESI).

2-cyano-6-hydroxy benzothiazole;β-lactamase; molecular probe; Bluco analogues; synthesis

2016-06-06

钟铮(1980-)，男，汉族，河南新乡人，博士，主要从事药物合成与合成方法学的研究。

孙德梅，高级实验师， E-mail: sam_zhong@yeah.net

O621.3

ADOI： 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.09.16139