槐耳浸膏逆转胃癌耐药细胞上皮间质转化的实验研究

徐志远　程向东　杜义安　吕航　张袁骕　陈佳辉

槐耳浸膏逆转胃癌耐药细胞上皮间质转化的实验研究

徐志远程向东★杜义安吕航张袁骕陈佳辉

目的 研究槐耳浸膏对胃癌耐药细胞（SGC7901/Fu）耐药性的逆转作用及对上皮间质转化（EMT）的影响。方法 CCK-8法计算SGC7901/Fu细胞的耐药性；光镜观察细胞形态的改变；realtime RT-PCR法检测EMT相关标记物、转录因子的表达；Western-blot法检测snail及Zeb2蛋白的表达；激光共聚焦显微镜观察E-cadherin的表达及分布。结果 0.1～ 0.5 mg/ml浓度范围内，槐耳浸膏能增加SGC-7901/FU细胞对5-Fu、DDP的敏感性；槐耳浸膏作用后SGC7901/Fu呈上皮样细胞形态改变，伴上皮表型标记物表达下调、间质表型标记物表达上调，侵袭能力增强。结论 槐耳浸膏能部分逆转SGC-7901/Fu细胞的耐药性，其机制可能是通过调控EMT而实现的。

胃癌 化疗耐药 上皮间质转化 槐耳

我国是胃癌高发地区之一，且中晚期胃癌（进展期胃癌）占较大的比例，化疗是胃癌综合治疗的主要手段之一，然而目前化疗总体有效率较低，其中多药耐药（multi-drug resistance，MDR）是制约胃癌化疗疗效的关键。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）与MDR的关系是目前肿瘤研究领域中的热点之一。前期研究发现槐耳浸膏能显著增加胃癌细胞对化疗的敏感性［1］，然而其作用机制尚不明确。为此，本课题用槐耳浸膏作用于体外培养的人胃癌耐药细胞SGC-7901/Fu，观察其EMT的变化，初步探讨槐耳浸膏逆转胃癌化疗耐药的机制。

1　材料与方法

1.1材料 人胃癌细胞株SGC7901购自中国科学院上海细胞库，SGC-7901/Fu为SGC7901的多耐药细胞株，用5-Fu逐步诱导其耐药性，由浙江省肿瘤医院肿瘤研究所诱导产生并长期保存；细胞RNA提取用Trizol（购自美国Ambion公司）；逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Real time试剂盒（购自日本TaKaRa公司）；蛋白提取用RIPA（购自上海碧云天公司）；兔抗人E-钙粘蛋白（E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）抗体（购自美国Epitomics公司）；兔抗人波形蛋白（vimentin）、snail、Zeb1、Zeb2、twist抗体（购自英国Abcam公司）；兔抗人β-catenin单克隆抗体（购自美国cell signaling technology公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖/毒性检测试剂盒（购自日本东仁化学公司）；槐耳浸膏（启东盖天力药业有限公司），将2g槐耳浸膏溶于20ml完全培养基中，用0.22μm微孔滤膜过滤后得到100mg/ml储备液，于-20℃长期储存，临用前解冻，用RPMI1640培养基稀释至所需浓度。

1.2方法 （1）细胞株与培养：SGC7901、SGC-7901/Fu细胞在含有10%胎牛血清的RPM1640中，置于37℃、含有5%CO2温箱中常规培养、传代。（2）中效浓度（IC50）计算：采用细胞增殖试剂盒CCK-8计算中效浓度。将SGC7901、SGC7901/Fu细胞均按1×104个/孔，接种于96孔培养板中，24h后更换培养液，加入不同浓度的药物，继续培养24h后，更换正常培养基（100μl/孔）并继续培养48h后，加入CCK-8（10μl/孔），并设置若干空白调零孔，将96孔板继续培养箱内孵育1～2h后取出，用酶标仪于450nm处检测各孔吸光度值（OD值），并按公式计算中效浓度［2］，以上实验重复3次。（3）细胞侵袭试验（transwell试验）：配制1：9稀释Matrigel胶，充分混匀后按每小室30μl铺胶至transwell小室内部的膜上，置37℃培育0.5h；将细胞吹散成单细胞悬液，取5×104个细胞，稀释至终体积200μl，加入Transwell小室的上室；下室加入600μl含20%血清的培养基，去除气泡后，常规培养48h，取出小室，甲醇固定25min，结晶紫染色30min，自来水冲洗后用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，将聚碳酸酯膜切下后贴在干净载玻片上，封片后细胞计数：随机选取5个视野（400×）计数细胞个数，取均数。（4）实时荧光定量聚合酶链反应（realtime RT-PCR）检测mRNA表达：用Trizol提取细胞的RNA，并逆转录成cDNA，采用SYBR Green染料法进行realtime RT-PCR反应，在384孔PCR反应板中按说明书依次加入各个组份，制成10μl的PCR反应体系，反应条件参考试剂说明。每次检测设立3个复孔，重复≥3次。运用2-△△Ct方法确定目的基因表达的相对水平。引物由上海生工设计合成，引物序列见文献［3］。（5）蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白的表达水平：分别将细胞悬于RIPA细胞裂解液，吹打均匀并室温剧烈振荡破碎40min，间隙冰浴。收集裂解液经20，000×g、4℃离心15min，取上清液。蛋白定量后分装，-70℃贮存备用。按照标准方法测定细胞中蛋白的表达，一抗稀释倍数参考抗体说明书。（6）激光共聚焦检测E-cadherin的表达和分布：前一天接种细胞至NEST小皿中，约（1～10）×105/皿，培养过夜；用4%多聚甲醛室温固定30min；0.1%～0.2%的triton X-100（用PBS配制，使用前现配）500μl/皿，破膜10min；用5% BSA 500μl/皿，封闭1h；根据说明书加入抗体，300μl/皿，放入4℃冰箱过夜；用1：1000的RNase 300μl/皿，作用20min；加入二抗300μl/皿，避光反应1h；用PBS洗3次（5min/次）后上机检测。

2　结果

2.1SGC-7901/Fu细胞的耐药性 在0.1～ 0.5 mg/ml浓度范围内槐耳浸膏与5-Fu、DDP联合用药时，可使SGC-7901/Fu细胞对5-Fu、DDP的IC50均明显下降（P＜0.05），对5-Fu和DDP的逆转倍数分别为1.23倍、1.31倍、 1.74倍、2.07倍、1.95倍和1.21倍、1.26倍、1.63倍、1. 35倍、1. 87倍，见表1。

表1　槐耳浸膏对SGC-7901/Fu耐药的逆转作用

2.2槐耳浸膏对细胞形态的影响 SGC7901细胞形态规则，大小均一，铺路石样或多边形，细胞间结合紧密（Fig 2A）；SGC7901/Fu细胞呈梭形生长为主，不规则，细胞体积略增大（Fig 2B）；经0.5mg/ml槐耳浸膏处理24h后，部分细胞SGC7901/Fu细胞细胞极性恢复，细胞间结合紧密（Fig 2C），提示SGC7901/Fu细胞发生了EMT，而槐耳浸膏能部分逆转该过程，见图1。

2.3槐耳浸膏对EMT标记物表达的影响 Realtime RT-PCR的方法检测了EMT相关标记物及转录因子mRNA的表达水平，结果提示槐耳浸膏组上皮表型标记物如E-cadherin、claudin-1的表达明显升高（P＜0.05），而间质表型标记物如Vimentin、β-catenin、Snail、Zeb2的表达显著降低（P＜0.05），N-cadherin、twist、slug的表达无明显差异，见图2。

图1　槐耳浸膏对SGC7901/Fu细胞形态的影响。A：SGC7901的细胞形态；B：SGC7901/Fu的细胞形态；C：槐耳浸膏作用后SGC7901/Fu的细胞形态

2.4槐耳浸膏对snail、Zeb2、E-cadherin表达的影响 进一步应用Western blot的方法检测槐耳浸膏对SGC-7901/Fu细胞Snail及Zeb2表达的影响，结果显示槐耳浸膏能显著降低SGC-7901/Fu细胞Snail及Zeb2的表达（图3A）。激光共聚焦显微镜检测提示槐耳浸膏组中E-cadherin的表达明显升高（图3B）。

图2　槐耳浸膏对SGC7901/Fu细胞EMT相关基因的表达的影响

图3　槐耳浸膏对Snail、Zeb2、E-cadherin表达的影响

3　讨论

近年来，从植物中提取的各种活性物质以其有效低毒的优势作为肿瘤治疗和疾病预防的替代物日益得到人们的重视，许多草药及天然产物在我国正应用于肿瘤治疗的临床实验中，对其作用机理的研究报道也日益增多。槐耳浸膏为槐耳真菌的热水提取物，具有较好的抗肿瘤效果。本课题组前期研究已证明槐耳浸膏能抑制胃癌细胞的增殖，并增加其对顺铂等化疗药物的敏感性［1］，但其在逆转胃癌化疗耐药中的作用尚不明确。本研究旨在进一步研究槐耳浸膏逆转胃癌耐药细胞SGC-7901/Fu耐药性的机制。

EMT与化疗耐药的关系是目前肿瘤研究领域中的热点之一［3］。EMT指上皮细胞在正常生理和特定病理情况下向间充质细胞转化的现象。EMT已被证实参与了人体许多生理、病理过程，而越来越多的研究表明EMT也是肿瘤耐药形成的重要原因，Harada K等［4］用5-Fu处理一系列口腔上皮癌细胞，发现残余癌细胞发生了EMT现象。前期研究也提示EMT是胃癌细胞获得化疗耐药的重要机制之一［5］。本课题通过细胞形态观察进一步证实胃癌耐药细胞SGC-7901/Fu发生了EMT，主要表现为细胞变梭形、细胞极性消失，而槐耳浸膏能使SGC-7901/Fu细胞恢复细胞极性，说明槐耳浸膏能部分逆转胃癌耐药细胞的EMT。

细胞标记物表达水平的改变是EMT的重要标记。发生EMT后上皮表型标记物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、ZO-1、claudin-1等表达下调，而间质表型标记物如N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等表达升高［6］，本研究提示槐耳浸膏作用于SGC-7901/Fu细胞后上皮表型标记物如E-cadherin、 claudin-1的表达明显升高，而间质表型标记物如Vimetin、β-catenin等表达显著降低。进一步证实槐耳浸膏能逆转胃癌耐药细胞的EMT。

各种病理因素诱导产生EMT的机制几乎都是与调控EMT相关转录因子有关［7］，这些转录因子包括snail、slug、twist1、twist2、Zeb1、Zeb2、Foxc1、Foxc2、FoxA1及Goosecoid等，其能直接调控上皮或间质表型标记物的表达。本项目通过realtime RT-PCR的方法检测了snail、slug、twist、Zeb2及Zeb2等的表达变化，结果提示槐耳浸膏能显著降低SGC-7901/Fu细胞中Snail及Zeb2的基因表达水平，Western-blot方法进一步验证了上述结果，说明槐耳浸膏逆转SGC-7901/Fu细胞EMT可能是通过调控转录因子Snail及Zeb2的基因而实现的。

综上所述，槐耳浸膏能显著升高胃癌耐药细胞SGC-7901/Fu中上皮表型标记物E-cadherin、claudin-1的表达，降低间质表型标记物Vimetin、β-catenin及转录因子Snail、Zeb2等的表达，提示槐耳浸膏逆转胃癌化疗耐药可能是通过调控其EMT而实现的。

［1］汪丽菁，谢华夏，徐志远，等.槐耳浸膏增加人胃腺癌细胞MKN45对顺铂敏感性研究.中华中医药杂志，2015，30（3）：868-871.

［2］徐志远，戴朝六，王宁.塞来昔布对人肝癌细胞株增殖及凋亡的影响.肿瘤学杂志， 2008， 14（11）： 902-905.

［3］Iwatsuki M， Mimori K， Yokobori T， et al. epithelial-mesenchymal transition in cancer development and its clinical significance. Cancer Sci， 2010，101（2）：293-399.

［4］Harada K， Ferdous T， Ueyama Y， et al. Establishment of 5-fluorouracil-resistant oral squamous cell carcinoma cell lines with epithelial to mesenchymal transition changes. Int J Oncol，2014， 44（4）：1302-1308.

［5］徐志远，程向东，杜义安，等. 化疗后残余胃癌细胞发生上皮间质转化的体外研究. 中国肿瘤临床，2013，40（18）：1085-1088.

［6］Natarajan J， Chandrashekar C， Radhakrishnan R. Critical biomarkers of epithelial-mesenchymal transition in the head and neck cancers. J Cancer Res Ther，2014， 10（3）：512-518.

［7］Lamouille S， Xu J， Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（3）： 178，196.

Objective To investigate the huaier's role in reversing chemoresistance and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of chemoresistant gastric cancer cells（SGC7901/Fu）. Methods CCK-8 method was used to determinate the reversal role of Huaier on the chemoresistance of SGC7901/Fu cells； the realtime RT-PCR was used to determine the expression level of EMT markers and EMT-related transcriptional factors；Western-blot was used to determine the protein level of snail and Zeb2； Confocal microscopy analysis was used to determine the change of expression and distribution of E-cadherin；Transwell analysis was used to the change of invasion ability. Results The combined used of Huaier，at 0.1～ 0.5 mg/ ml concentration，and DDP or 5-Fu could increase the chemo-sensitivity of SGC7901/Fu cells to DDP and 5-Fu；The use of Huaier on SGC7901/ Fu cells resulted in mesenchymal appearance，decreased expression of epithelial markers and increased expression of mesenchymal markers. Conclusion Huaier could partly reverse the chemoresistance of SGC7901/Fu cells，the underline mechanism might include regulating EMT process.

Gastric cancer Chemoresistance Epithelial-mesenchymal transition Huaier

浙江省中医药重点研究计划（2012ZZ002）；浙江省

中医药管理局一般项目（2013ZA022，2015ZA090）

310006 浙江中医药大学附属第一医院胃肠外科

（徐志远 程向东 吕航 张袁骕 陈佳辉）

310022 浙江省肿瘤医院腹部肿瘤外科（杜义安）