小鼠尾悬吊法模拟微重力对骨代谢的影响

李　煜，张新昌，朱　雷，李　军，孙明林



小鼠尾悬吊法模拟微重力对骨代谢的影响

李煜1，张新昌2，朱雷1，李军1，孙明林1

目的研究模拟微重力条件对小鼠骨代谢的影响。方法8周龄野生型C57小鼠，分别尾悬吊0周(对照组)、2周、4周，检测小鼠血清生化指标(Ca2+、ALP、BGP)；分离股骨行Micro-CT扫描，检测股骨微观结构的改变；三点弯曲试验检测股骨的力学性能。所得数据用SPSS18.0进行统计学分析。结果与对照组相比，尾悬吊2、4周组小鼠血清Ca2+浓度依次升高，而血清ALP、BGP浓度逐渐降低：血清Ca2+在悬吊0、2、4周值为(2.134±0.081)mmol/L，(2.261±0.079)mmol/L，(2.388±0.061)mmol/L，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)；血清ALP浓度为(4.598±0.478)U/100 ml，(3.447±0.393)U/100 ml，(3.142±0.328)U/100 ml，差异具有统计学意义；血清BGP浓度(8.529±0.523)ng/ml、(8.108±0.392)ng/ml、(7.832±0.282)ng/ml。股骨Micro-CT扫描结果显示：悬吊组小鼠股骨骨小梁数量减少，间隙增大，厚度降低，其中以骨体积比下降最为明显，悬吊2、4周值为对照组的47.3%、14.3%。三点弯曲结果显示尾悬吊后股骨极限强度及弹性模量均降低，对力耐受减弱，对照组、悬吊2、4周股骨骨折断裂能量为(6.220±0.482)mJ；(4.395±0.301)mJ；(2.855±0.425)mJ,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。结论尾悬吊法能造成小鼠骨钙流失和骨质疏松，且严重程度与悬吊时间成正相关。

微重力；尾悬吊；骨质疏松；小鼠

失重条件对骨的破坏比其对其他组织破坏更明显，更严重。它导致短时间内大量骨钙流失，造成严重的骨质疏松，使骨的脆性增加，骨折的风险增高；同时短时间内较多的Ca2+进入血液系统，又会对机体造成其他不良后果[1]。因此，进一步研究微重力条件对骨组织本身及骨代谢的影响就显得尤为重要。本实验采用C57小鼠尾悬吊法模拟微重力条件，分别悬吊2、4周，检测不同微重力时间下小鼠骨结构及力学性能的改变，为应对失重对骨质疏松及其他不良反应提供资料。

1　材料与方法

1.1实验材料与仪器野生型C57小鼠(由军事医学科学院动物研究所提供)、戊巴比妥钠(国药集团化学试剂公司)、钙测定试剂盒(南京城建)、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(南京城建)、BGP ELISA 检测试剂盒(碧云天生物技术公司)、苏木精伊红染色试剂盒(HE染色试剂盒，武汉博士德生物公司)。主要仪器：电子天平(美国Denver)、低温高速离心机(德国Eppendorf公司)、紫外可见分光光度仪(美国BD公司)、酶标仪(瑞士TECAN公司)、INSTRON 5865材料试验机(美国INSTRON公司)、Skyscan 1076 Micro-CT扫描仪(比利时Skyscan公司)、冰冻切片机(德国LEICA公司)。

1.2分组及尾悬吊模型8周龄C57小鼠18只，雌雄不限，随机分成3组，并记录体重。保持鼠笼洁净，保证充足的食物及清水供应及足够的光照，环境温度维持在(23±3)℃。悬吊组小鼠尾巴用医用胶布固定，细线一段悬吊尾巴，另一端固定在饲养笼上。使小鼠后肢不能接触地面，前肢着地。小鼠头躯干与水平面膜呈30°，能够自由饮水及取食。分别培养2、4周，悬吊结束再次称量小鼠体重，体重下降15%记为悬吊失败。对照组小鼠在鼠笼中不行尾悬吊饲养。

1.3小鼠血清生化指标各组小鼠悬吊结束后，断头取血，离心获取血清并做好标记，-20 ℃保存。取适量血清分别与相应的检测试剂反应，在分光光度计或酶标仪对应波长下得出吸光度(OD值)，并由此计算出Ca2+、ALP及BGP浓度。

1.4方法小鼠Micro-CT 股骨扫描小鼠处死后，立即剥离股骨至EP管中，每管加入少量PBS，保持骨组织湿润，做好标记，-80 ℃保存，用Skyscan 1076 Micro-CT(由北京航空航天大学提供)扫描股骨，分辨率设置为9 μm，进行3维重建，最后得出骨体积比(BV/TV)，骨小梁模式因子(Tb. Pf)，骨小梁厚度(Tb. Th)，骨小梁数量(Tb. N)，和骨小梁分离度(Tb. Sp)等股骨三维相关参数，评估各组小鼠股骨微观结构的变化。

股骨三点弯曲试验取分离好的骨组织，用INSTRON 5865试验机对其进行三点弯曲试验，跨距设为1 cm，加载速度2 mm/min，匀速加载，记录载荷-变形曲线，得到各组股骨力学相关参数：断裂位移、断裂应变、断裂载荷和断裂能量，做统计学分析，并评估骨的力学性能。

2　结　　果

2.1一般情况小鼠尾悬吊各组小鼠生长良好，无一死亡，悬吊2周、4周组各有1只小鼠体重下降超过15%，不计入实验对象，其余小鼠符合试验要求。

2.2血清生化指标检测与对照组相比，悬吊2、4周小鼠血清Ca2+均出现升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，悬吊4周血清Ca2+升高幅度更大；悬吊2、4周血清ALP浓度均下降，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，悬吊4周血清ALP浓度下降更明显；悬吊2周小鼠血清BGP浓度未见明显下降，差异无统计学意义，悬吊4周BGP浓度出现明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1　小鼠血清生化指标检测值　±s)

注：与对照组比较，①P<0.05；②P<0.01

2.3Micro-CT扫描股骨CT扫描成像结果尾悬吊小鼠均表现出不同程度骨质疏松，骨小梁数量减少，间距增宽(图1)；股骨三维重建数据同样显示尾悬吊小鼠骨小梁数目降低，厚度减少，分离度增宽，骨小梁模式因子增大，表现出骨质疏松症状，且悬吊4周小鼠表现出更明显的骨质疏松症状(表2)。

图1　Micro-CT扫描各组小鼠股骨图

指标对照组(n=6)悬吊2周(n=5)悬吊4周(n=5)BV/TV(%)9.149±0.3124.319±0.292②1.304±0.199②Tb.Pf(1/mm)24.320±1.15631.120±1.745②37.610±1.964①Tb.Th(μm)67.730±3.65058.280±2.470①50.230±2.050①Tb.N(1/mm)1.599±0.0390.950±0.035①0.444±0.018②Tb.Sp(mm)0.248±0.0130.391±0.012①0.568±0.015②

注：Micro-CT检测股骨相关参数：BV/TV(骨体积比)，Tb. Pf(骨小梁模式因子)，Tb. Th(骨小梁厚度)，Tb. N(骨小梁数量)，Tb. Sp(骨小梁分离度)。与对照组比较，①P<0.05，②P<0.01

2.4小鼠股骨三点弯曲试验由于尾悬吊小鼠出现较为明显的骨质疏松情况，导致小鼠股骨力学性能的下降，使骨的弹性模量及对力的耐受降低，股骨三点弯曲试验能够较好的检测股骨的力学性能。对各组小鼠股骨行三点弯曲试验结果显示，和对照组相比，悬吊2周小鼠股骨断裂位移、断裂应变、断裂载荷、断裂能量均显著下降(P<0.05)，悬吊4周后骨的上述参数下降更明显(P<0.01，表3)。

表3　小鼠股骨三点弯曲力学实验结果　±s)

注：与对照组比较，①P<0.05，②P<0.01

3　讨　　论

人体的骨骼起着支撑、运动和保护机体的重要作用，是机体的重要组成部分。骨质疏松的形成有其复杂的成因，如糖尿病患者中骨质疏松的发病率远高于健康人群[2]，骨质疏松的危险因素还有吸烟、饮酒、糖皮质激素的滥用等[3]。一定的外界力学载荷刺激能促进骨的形成及矿化，能较有效的延缓骨质疏松出现。因此，在地球上，重力作用对维持骨的健康起着重要作用，而太空中飞行员由于失去重力后不可避免的会出现失重性骨质疏松；久卧在床，行动不便的病人同样会出现废用性骨质疏松，使骨强度降低，抗外力作用减弱，极易发生骨折，给机体的健康及生活带来严重影响[4]。尾悬吊法能较好的模拟失重环境对骨组织本身及骨代谢引起的其他问题，该法最早由MOREY-HOLTON 和 WRONSKI建立，经过不断改进现在已成为较成熟的研究失重条件对机体影响的方法之一。史晓等[5]通过检测尾悬吊大鼠腰椎骨密度变化，发现尾悬吊法能很好地制造出骨质疏松模型。但尾悬吊法使得小鼠头部较低，尾部较高，对小鼠有一定的影响，尤其在悬吊前3 d会出现进食减少，活动降低，身体消瘦，情绪低落等[6]。为此，在该试验中小鼠体重下降超过15%，即为悬吊失败，以排除进食减少、小鼠适应性差等混杂因素的干扰[7]。

Guo等[8]发现，尾悬吊28 d大鼠股骨骨小梁减少，排列稀疏，同时他还发现悬吊组4周大鼠股骨中成骨细胞数量较对照组明显下降。Dave等[9]发现，尾悬吊2周大鼠出现皮质骨和松质骨明显减少,骨小梁厚度及数量也均减少，网状结构连接稀疏，骨形成率显著降低。在本研究中，尾悬吊2周后小鼠骨小梁即出现一定程度的下降，而悬吊4周骨小梁出现明显下降，骨小梁稀疏，网状结构减少，与皮质骨节点减少，游离骨小梁增多。均表明尾悬吊小鼠出现明显骨质疏松症状。

BGP是骨中含量丰富的非胶原蛋白，能促进骨的形成，它的合成受1,25-(OH)2D3调节[10]。付重建等[11]通过悬吊大鼠股骨原位杂交及三色染色法示悬吊2、4周大鼠骨组织髓中BGP表达量均出现下降，悬吊2周股骨BGP含量高于悬吊4周。同时随着悬吊时间延长，股骨脱钙现象更明显。本研究结果发现，尾悬吊小鼠出现血清BGP浓度降低，与骨中BGP变化趋势相一致。同时，血清中增高的Ca2+与骨质破坏程度，骨中钙丢失量密切相关。即骨质疏松越严重，血清Ca2+浓度升高越明显[12]。

失重性骨质疏松患者由于骨质的破坏导致骨脆性增加，在较小应力下即可出现股骨粗隆和腰椎骨折，表明其骨的强度下降。在尾悬吊小鼠三点弯曲试验中，小鼠断裂负荷、断裂位移均降低，精确表明骨质抗外力作用减弱。李昊等[13]发现，适当的外力刺激对小鼠骨质疏松具有较好的治疗作用。同时发现，在适当的刺激一段时间后之后，小鼠骨质疏松状况明显缓解，同时血清Ca2+和BGP浓度也随之下降，二者之间有较好的相关性。由于骨质疏松患者常常出现骨折症状才进行针对性治疗，给患者带来较大的痛苦及经济压力[14]，能否根据血清Ca2+、BGP浓度判断患者骨质疏松严重程度，进行有效预防，尚需进一步研究。

综上所述，尾悬吊法能造成小鼠骨钙流失和骨质疏松，且严重程度且与悬吊时间成正相关。下一步，将对血清Ca2+、BGP浓度与骨质疏松程度是否存在一定关系进行研究。

[1]Saxena R, Pan G, McDonald J M. Osteoblast and osteoclast differentiation in modeled microgravity [J]. Ann N Y Acad Sci, 2007,1116:494-498.

[2]董松,崔立芹,雷蕾,等.2型糖尿病并发骨质疏松的相关危险因素[J]. 武警医学，2015，26(8):824-827.

[3]宫丽娜,牛志燕,苏巍.糖皮质激素性骨质疏松伴多发脆性骨折[J]. 武警医学，2015，26(7):753-754.

[4]Ohshima H, Mukai C. Bone metabolism in human space flight and bed rest study[J]. Clin Calcium, 2008,18(9): 1245-1253.

[5]史晓,王翔,杜修东,等. 大鼠尾悬吊骨质疏松模型初探[J].中国现代医学杂志2009,19(2): 341-343.

[6]章晓东,余震,刘纳新.大鼠体力及精神状态评价的行为学新技术[J].温州医学院学报，2009,13(2):137-140.

[7]宋敏,李晶.大鼠骨质疏松模型的复制方法及意义[J].当代医学,2012,8(6):16-18.

[8]Guo R, Hh M, Sun Z Y,etal. Effects of simulated weightlessness on rats mandible, lumbar vertebra and femur [J]. SpaceM Med Eng, 2005, 18(3):165-169.

[9]Dave V, Lafage P H, Laroche N,etal. Two-week longitud in al survey of bone arch-itecture alteration in the hind limb-unloaded rat model of bone loss:sex differences[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2014,9(3):440-447.

[10]Tsuji H, Cawthorn C, Ecarot B. Abnormal modulation of serum osteocalcin by dietary phosphate and 1,25-dihydroxyvitamin D3 in the hypophosphatemic mouse [J].Bone Miner Res,2013, 11(9): 1234-1240.

[11]付重建,郁冰冰,杨连甲,等.尾悬吊大鼠骨和骨髓中骨钙素的变化[J].航天医学与医学工程,2005,16(4):260-263.

[12]Wu D D, Boyd R D, Fix T J,etal. Regional patterns of bone loss and altered bone remodeling in response to calcium deprivation in laboratory rabbits [J]. Calcif Tissue Int, 1990, 47(1): 18-23.

[13]李昊, 李瑞欣, 张西正, 等. 周期性动态力学载荷对抗骨质疏松的研究[C].北京：军事医学科学院出版社,2013：31-42.

[14]Zhu W, Yang M L, Yang GY,etal. Changes in serum runt-related transcription factor 2 levels after a 6-month treatment with recombinant human parathyroid hormone in patients with osteoporosis [J]. Endocrinol Invest，2012, 35(6): 602-606.

(2015-06-11收稿2015-12-28修回)

(责任编辑郭青)

Effect of microgravity simulated by mouse tail-suspension on bone

LI Yu1, ZHANG Xinhang2, ZHU Lei1, LI Jun1, and SUN Minlin1.

1.Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Logistical College of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China;2. Department of Biochemistry and Molecular Biology of Logistical College of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162,China

ObjectiveTo study the effect of microgravity on the bone itself and metabolism.Methods8-week-old widetype C57 mice were tail-suspended for 0, 2, 4, weeks. Related serum biochemical indices (Ca2+, ALP, BGP) were measured. Microstructure of bone was observed by micro-CT scanning. Three point bending test on the femurs by material testing machine helped to compare the changes of mechanical parameters. All the data were analysed.by SPSS18.0.ResultsCompared with control group, tail-suspended groups had a higher concentration in calcium in serum,the values of which were (2.134±0.08114) mmol/L, (2.261±0.07913) mmol/L, and (2.388±0.06112) mmol/L; lower levels of serum ALP and BGP, the difference was significant with a longer tail-suspension. The values of ALP was (4.598±0.4783) U/100 ml, (3.447±0.3930) U/100 ml, and (3.142±0.3280) U/100 ml; and the values of BGP were (8.529±0.5233) ng/ml, (8.108±0.3920) ng/ml, and (7.832±0.2821) ng/ml, which had statistically significant difference compared with control group (P<0.05).The scanning of femur showed obviously osteoporosis in tail-suspended mice. Compared with control group, number of bone trabecular reduced, the gap between them widened, thickness decreased simultaneously in the tail-suspended mice. Among which, BV/TV decreased most, the values of tailed-suspension for 2 and 4 weeks were 47.3% and 14.3% in the control group; There was a positive relationship between the osteoporosis and the time of tail-suspension. Mechanical parameters showed that the force decreased as well. Simulated microgravity promoted the loss of calcium in bone, mechanical properties of femurs of suspended-mice decreased, their capability of resistance to force decreasedas well. The forces to bone fracture in tailed-suspension for 0, 2 and 4 weeks were (6.220±0.482)mJ, (4.395±0.301)mJ, and (2.855±0.425)mJ, which had statistically significant difference compared with control group (P<0.05).ConclusionsSimulated microgravity promotes the loss of calcium in bone, which can lead to osteoporosis, and the degree of that has a positive relationship to the time.

microgravity; tail suspension; osteoporosis; mouse

李煜，硕士研究生。

1.300162天津，武警后勤学院附属医院脊柱一科，2.300309天津，武警后勤学院分子生物教研室

孙明林, E-mail：sunmlren@sohu.com

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