PTEN、VEGF在人脑星形细胞瘤的表达及意义

张亚东，高玉松，王海伟，罗新民，胡承啸

河南驻马店市解放军159中心医院神经外科，河南驻马店463000

PTEN、VEGF在人脑星形细胞瘤的表达及意义

张亚东，高玉松，王海伟，罗新民，胡承啸

河南驻马店市解放军159中心医院神经外科，河南驻马店463000

目的 探讨PTEN及VEGF与脑星形细胞瘤发生、发展的关系，寻找抑制脑星形细胞瘤生长和侵袭的有效方法。方法 方便选取2012年11月—2015年11月该院收治的49例星形细胞瘤采用免疫组化SP法检测了49例脑星形细胞瘤及正常脑组织中PTEN基因蛋白及血管内皮细胞生长因子的表达情况，并探讨了PTEN与VEGF的相互关系。结果 脑星形细胞瘤组织中PTEN蛋白表达率显著低于正常脑组织（P＜0.05），且瘤组织分化程度越低，PTEN阳性率越低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；VEGF蛋白表达在正常脑组织为阴性，且在Ⅰ～Ⅱ级与Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤（r=-0.342，P＜0.05）、瘤组织与正常组织相比均差异有统计学意义（P＜0.01）；PTEN蛋白的表达和VEGF蛋白表达之间呈负相关关系（P＜0.05）。结论 脑星形细胞瘤组织中PTEN蛋白表达的减少或缺失，均可导致VEGF的表达上升，进而生成肿瘤血管，最终为脑星形细胞瘤的生长和浸润提供重要的基础。

星形细胞瘤；PTEN；VEGF；免疫组化

［Abstract］Objective PTEN and VEGF and astrocytoma，development of relations，to find an effective method of brain astrocytoma growth and invasion inhibition.Methods Convenient select November 2012 to November 2015 in the hospital were 49 cases of astrocytoma in 49 cases of astrocytoma and normal brain tissue PTEN protein and vascular endothelial cell growth factor expression was detected by immunohistochemical staining（SP method），and to investigate the relationship between PTEN and VEGF.Results Astrocytoma of PTEN protein expression was significantly lower than in normal brain tissue（P＜0.05），and the lower the degree of differentiation of tumor tissue，the lower the rate of PTEN，a statistically significant difference（P＜0.05）；VEGF protein expression in normal brain tissue was negative，and in gradeⅠ～Ⅱ andⅢ～Ⅳgrade astrocytomas（P＜0.05），tumor tissue and normal tissue（P＜0.01）were significantly different compared；.PTEN protein negative correlation（r=-0.342，P＜0.05）between the expression and protein expression of VEGF.Conclusion Astrocytoma of PTEN protein expression is reduced or absent，can lead to increased expression of VEGF，thereby generating tumor blood vessels，and ultimately provide an important basis for the growth of brain astrocytoma and infiltration.

［Key words］Astrocytoma；PTEN；VEGF；Immunohistochemistry

既往研究已证明，PTEN（第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因）的失活与人类许多恶性肿瘤的发生、发展有关［1-2］，并且它还可通过抑制肿瘤血管生成而抑制肿瘤生长、浸润。VEGF（血管内皮细胞生长因子）作为一种特异性血管生产因子，得到医学界的广泛研究，且据相关研究显示，人类多种肿瘤的发生与转移均与该血管生产因子有关［3］。而目前在脑星形细胞瘤中，PTEN基因与肿瘤血管生成的关系的研究较少。该文方便选取2012年11月—2015年11月该院收治的49例星形细胞瘤本患者采用免疫组化SP法对49例脑星形细胞瘤及正常脑组织中PTEN基因蛋白及VEGF进行了检测，探讨其与脑星形细胞瘤的关系。现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般治疗

方便选取49例星形细胞瘤手术标本取自解放军第159中心医院收治的的患者标本，其中男29例，女20例，年龄20～71岁。病理分级依WHO星形细胞瘤病理级别判定标准分级，其中Ⅰ级15例，Ⅱ级14例，Ⅲ级11例，Ⅳ级9例。所有病例均为首次发病，术前未经化疗、放疗或生物治疗。正常脑组织10例为脑外伤减压术中切除的脑组织。49例标本均在离体0.5 h内迅速取材，并将其置于冻存管，而后将冻存管存放于冰箱（温度为-80℃）。剩余组织在中性缓冲甲醛液 （浓度4%）的作用下固定，而后进行石蜡包埋切片，将其用于免疫组织化学染色与临床诊断。

1.2试剂

鼠抗人VEGF单克隆抗体，SP免疫组化试剂盒，鼠抗人PTEN克隆抗体。

1.3检测方法

采用链酶亲和素-生物素过氧化物酶复合物法（SP法）。阴性对照：I抗采用正常羊血清来代表，结果为阴性；阳性对照：用已知阳性的结肠癌作VEGF阳性对照，PTEN阳性表达的则将已知乳腺癌组织作为阳性对照；空白对照：I抗采用PBS来代表，结果为阴性。免疫组织化学染色步骤如下：①对石蜡切片标本进行脱蜡至水；②将标本放在H2O2（浓度为3%）内，保持常规室温，30 min。采用PBS洗3次，5 min/次；③备用塑料盒，并将枸橼酸盐抗原修复液置于塑料盒，将标本放在塑料盒内，并进行高压修复，持续时间为20 min；④待其自然冷却后，采用PBS洗3次，5 min/次；⑤将封闭血清（浓度为10%）滴在标本上，常规室温，持续30 min；⑥将血清去除，并将1：100稀释度的VEGF与PTEN的单克隆抗体分别滴加在切片上，将其置于温度为4℃的湿盒内，过夜，采用PBS洗3次，5 min/次；⑦将生物素化二抗工作液滴上，将其置于温度为37℃的湿盒内，持续30 min，采用PBS洗3次，5 min/次；⑧将链霉卵白素工作液滴上，将其置于温度为37℃的湿盒内，持续10 min，采用PBS洗3次，5 min/次；⑨切片滴加DAB底物工作液，对其显色进行控制，并用自来水将其显色反应终止；⑩采用苏木素实施复染，并用酒精进行脱水处理，二甲苯透明，中性树胶对其封固。

1.4结果判定

参照文献［4］，确定凡细胞质或胞核出现明显的棕色颗粒为PTEN蛋白阳性细胞。每一例切片选5个高倍视野，按阳性细胞数占同类细胞计数的百分比，将免疫组化结果分为：强阳性（+++），阳性细胞数为＞50%，中度阳性（++），阳性细胞数为25%～50%，；弱阳性（+），阳性细胞数为5%～25%，阴性（-），阳性细胞数＜5%。VEGF阳性显色为棕黄色颗粒，定位于胞浆。

1.5统计方法

采用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析，其中脑星形细胞瘤及正常脑组织中PTEN蛋白的表达及VEGF蛋白的表达等计数资料采用χ2检验；PTEN蛋白的表达与VEGF蛋白表达的相关性采用Spearman相关分析，P＜0.05表示对比差异有统计学意义。

2　实验结果

2.1脑星形细胞瘤及正常脑组织中PTEN蛋白的表达

脑星形细胞瘤组织中PTEN蛋白表达率53.1%（26/ 49），显著低于正常脑组织100.0%（P＜0.05），且强度也明显弱于正常脑组织。在Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ～Ⅳ级脑星形细胞瘤组织中PTEN蛋白表达的结果显示，瘤组织分化程度越低，PTEN阳性率越低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　脑星形细胞瘤及正常脑组织PTEN蛋白的表达与临床病理特征的关系

2.2脑星形细胞瘤及正常脑组织中VEGF蛋白的表达

在正常脑组织中VEGF蛋白表达阴性。Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤中VEGF蛋白表达的阳性率分别为51.6%、88.9%，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；瘤组织与正常脑组织相比，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2　脑星形细胞瘤及正常脑组织中VEGF蛋白表达

2.3 PTEN蛋白的表达与VEGF蛋白表达的相关性分析

PTEN蛋白的表达与VEGF的关系。PTEN蛋白表达阴性的病例中，VEGF蛋白的阳性表达率为82.6%（19/23），PTEN蛋白表达阳性的病例中，VEGF蛋白的阳性表达率为50.0%（13/26）。经统计学分析，PTEN蛋白的表达和VEGF蛋白表达之间呈负相关关系（γ=-0.342，P=0.016）。见表3。

表3　PTEN蛋白的表达与VEGF的关系

3　讨论

3.1 PTEN与脑星形细胞瘤

PTEN基因作为一种新型肿瘤抑制基因在维持细胞的增殖、分化和凋亡平衡中起重要作用，并可能参与调节细胞生长，肿瘤浸润、转移和血管形成［5］。当PTEN基因在翻译、转录、局域化分布和半衰期发生异常改变或失去严格控制时，则其在体内不能发挥正常的功能。这些PTEN基因的异常改变可以影响到脑星形细胞瘤的发生、发展、凋亡等生物学行为。有研究表明，PTEN基因的失活与人类许多恶性肿瘤的发生有关［6］，其失活时可表现为PTEN mRNA或蛋白表达降低，甚至不表达以及PTEN基因的缺失或（和）突变。该研究检测了正常人脑组织和人脑星形细胞瘤组织中PTEN蛋白表达（采用免疫组化法），结果显示，PTEN蛋白的阳性表达在星形细胞瘤组织中明显低于正常脑，差异有统计学意义（P＜0.01），且在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级瘤组织中PTEN蛋白的表达呈逐渐降低趋势，其中Ⅰ～Ⅱ级与Ⅲ～Ⅳ级差异有统计学意义（P＜0.05）。上述结果提示，与正常脑组织相比，部分瘤组织PTEN蛋白缺失或表达减弱，PTEN蛋白表达降低也可能参与脑细胞的恶性转化过程，WHO分级越高，其表达越低，我们可以观察到该基因的失活在脑星形细胞瘤的恶性阶段最为明显，这结果提示该基因与星形细胞瘤的进展密切相关，可以作为患者病情发展及预后的判断指标，并且提示是否可以作为潜在靶点用于基因治疗，值得进一步研究。

3.2 VEGF蛋白与脑星形细胞瘤

实体肿瘤若无新生血管，仅能自发生长至直径2 mm体积，若其继续生长、增殖及侵袭则有赖于新生血管的生成［7］。脑星形细胞瘤属特殊肿瘤之一，富含血管，主要以局部浸润为主，很难对其远隔转移观察到，VEGF则在肿瘤的血管生成过程中发挥了很大的作用，它对细胞有丝分裂原可产生最直接的作用，进而使微血管、初级毛细血管、小静脉以及后静脉的通透性得以提升；对血管内皮细胞的增殖反应产生袭击，进而提成血管的形成率［8-10］。VEGF（即血管通透因子）具有以下两种功能：①经受体对血管内皮细胞的增殖反应产生最直接的刺激作用，对蛋白水解酶、组织因子及间质胶原酶的产生产生诱导作用，进而提升血管的生成率；②能够使血管的通透性得以有效增加，进而使纤维蛋白原及血浆蛋白发生外渗，引发肿瘤间质出现水肿反应，改变细胞外基质，最终为肿瘤浸润与生长提供重要基础［19］。该研究可以观察到VEGF在高度恶性星形细胞瘤阳性表达率达77.77%，而在低级别星形细胞瘤中VEGF阳性表达率仅为25.00%，结果提示：VEGF表达与星形细胞瘤组织分化程度密切相关。同时通过分析VEGF表达与星形细胞瘤组织分化程度的相关性提示我们应用VEGF抗体封闭其蛋白的表达，可能通过抑制肿瘤血管形成的机理，降低恶性星形细胞瘤的生长速度与侵袭性，提高患者的生存率。

3.3脑星形细胞瘤中PTEN和VEGF蛋白表达的相关性

通过该组研究结果可以看到VEGF蛋白的表达与PTEN蛋白的阳性表达呈负相关关系，也就是说在PTEN蛋白表达阴性的病例中VEGF蛋白的阳性表达率明显高于PTEN蛋白表达阳性的病例（P＜0.05）；这就提示PTEN蛋白表达的降低或缺失可能上调VEGF的表达，从而促进星形细胞瘤血管的生成，为肿瘤的生长和浸润提供了条件。

综上所述，通过本实验表明PTEN蛋白表达的降低或缺失和VEGF表达的上调是脑星形细胞瘤在发生发展过程中的两个重要因素，联合检测PTEN、VEGF可作为判定脑星形细胞瘤预后判断的一项客观指标，而PTEN作为一个抑癌基因则可能通过影响VEGF表达的信号传导途径而抑制脑星形细胞瘤血管的形成。

［1］Cheney IW，Neuteboom ST，VAillancourt MT，et al.Adenovirus-mediated gene tranfer of MMACl/PTEN to gliblastuma cells inhibits S phase entry by the recruitment of P27 kipl into cyclin E/CDK2 complexes［J］.Cancer Res，1999，59（10）：2318-2323.

［2］Kunes K，Zhou xP，Araki T，et al.Frequent loss of PTEN expression is linked to elevated phosphory lated Aktlevels but not associated with P27 and cyclinD1 expression，in primary epithelial ovarian carcinomas［J］.Am J Pthol，2001，158（6）：2097-2106.

［3］Harold F，Dvorak，Lawrence F，et al.Vascular permeability factor，micro vascular hyperpeameability and angiogensis［J］. Am J Pathol，2015，146（5），1029-1039.

［4］郑华川，陈颖，纪立革，等.PTEN编码产物在胃癌发生发展不同阶段中的表达及意义［J］.中华肿瘤杂志，2013，25（1）：13-16.

［5］Simpson L，Parsons R.PTEN：life as a tumor suppressor［J］. Exp Cell Res，2012，264（1）：29-34.

［7］黄纯海，李学军，周异曾，等.EGFL7在人脑胶质瘤中的表达及其与微血管密度的关系［J］.中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2013，15（5）：336-345.

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［10］高文宏，陈谦学，刘刚.内皮抑素和血管内皮生长因子在脑胶质瘤中的表达及意义［J］.中国临床神经外科杂志，2015，11（2）：86-91.

［11］Adams J，Carder PJ，Banks RE.Vascular endothelial growthfactor（VEGF）in breast cancer：comparison of plasma，serum，and tissue VEGF and micro vessel density and effects of tamox-ifen［J］.CancerRes，2015，60（11）：2989-2994.

The Expression and Significance of PTEN、VEGF in Human Brain Astrocytoma

ZHANG Ya-dong，GAO Yu-song，WANG Hai-wei，LUO Xin-min，HU Ceng-xiao
Department of Neurosurgery，the 159th Hospital of PLA，Zhumadian，Henan Province，463000 China

R739

A

1674-0742（2016）09（c）－0011-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.27.011

2016-05-05）

张亚东（1973-），男，河南驻马店人，硕士，主任医师，研究方向：神经康复学。