UPLC-MS/MS测定葡萄酒中3种双酰胺类杀虫剂

张　云，程立军，侯　杰，陈泽宇，朱海燕

（1.三明出入境检验检疫局，福建 三明 365000；2.三明学院 资源与化工学院，福建 三明 365000）

UPLC-MS/MS测定葡萄酒中3种双酰胺类杀虫剂

张云1，程立军1，侯杰1，陈泽宇1，朱海燕2

（1.三明出入境检验检疫局，福建 三明 365000；2.三明学院 资源与化工学院，福建 三明 365000）

建立了葡萄酒中氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟苯虫酰胺等3种双酰胺类杀虫剂残留量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS/MS）检测方法。葡萄酒中的3种双酰胺类杀虫剂经乙腈提取后，用GCB/NH2固相萃取柱净化，以乙腈-5 mmol/L乙酸铵-甲酸作为流动相，梯度洗脱，通过UPLC-MS/MS进行测定。结果表明，3种双酰胺类杀虫剂在质量浓度1～20 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数（R）≥0.999 5，方法检出限＜1.0 μg/kg；以1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10 μg/kg为添加水平，平均回收率在76.3%～91.1%之间，相对标准偏差（RSD）为3.9%～9.8%。表明该方法快速简便、净化效果好、准确度较好、精密度较高，可应用于葡萄酒中3种双酰胺类杀虫剂的同时测定。

葡萄酒；双酰胺类杀虫剂；超高效液相色谱-串联质谱；测定

葡萄酒是以新鲜的葡萄为原料，经过发酵酿造而成的酒精饮料［1］。其中富含多种营养成分，具有预防心脑血管疾病和抗衰老等保健功效［2］。随着人们生活水平的不断提高，葡萄酒的需求量逐年增加。然而葡萄在种植过程中容易受病虫害感染，防治病虫害的主要农药有苯并咪唑类和双酰胺类等［3］。氰虫酰胺（cyantraniliprole）、氯虫苯甲酰胺（chloranteraniliprole）和氟苯虫酰胺（flubendiamide）是目前市面上常见的3种双酰胺类杀虫剂。该类杀虫剂的最大特点是能有效刺激昆虫体内的鱼尼丁受体（ryanodine receptor，RyR），促进细胞内钙离子的过量流失，引起昆虫瘫痪导致死亡［4］，可有效防治鳞翅目、鞘翅目和半翅目等昆虫［5-6］。研究表明，长期饮用含有农药残留的葡萄酒会导致慢性中毒。

目前，国内外有关双酰胺类杀虫剂检测报道，主要集中在原药［7］、土壤和植物性食品［8-9］以及动物性食品［10-11］中，而同时测定葡萄酒中氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺等双酰胺类杀虫剂的超高效液相色谱-串联质谱（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测方法鲜有报道。本试验结合固相萃取（solid phase extraction，SPE）技术，研究了超高效液相色谱-串联质谱在电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）多反应检测模式（multiple reaction monitoring，MRM）条件下，对葡萄酒中3种双酰胺类目标物有效成分进行定性定量分析。该方法填补了国内葡萄酒中检测双酰胺类杀虫剂的研究空白。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

葡萄酒：市售。氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟苯虫酰胺标准品（纯度均≥97%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸、乙腈（均为色谱纯）：德国默克公司；乙酸胺（色谱纯）：美国Tedia公司；无水硫酸镁、无水硫酸钠（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司。

1.2仪器与设备

LC-30AD超高效液相色谱：日本SHIMADZU公司；AB SCIEX 3500三重四级杆串联质谱仪（配电喷雾离子（electronicsprayion，ESI）源）：美国ABSCIEX公司；Sepline-4自动固相萃取装置：北京莱伯泰科公司；GCB/NH2固相萃取柱（500 mg/500 mg，6 mL）、PSA固相萃取柱（500mg，3mL）、C18固相萃取柱（500 mg，3 mL）、HLB固相萃取柱（500 mg，3 mL）：北京艾杰尔科技有限公司；L-550离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；AE240电子天平：瑞士梅特勒公司；EV311旋转蒸发仪：北京莱伯泰科公司；KQ-500DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司：Direct8超纯水机：美国Millipore公司。

1.3实验方法

1.3.1样品前处理

取5 mL葡萄酒于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，漩涡混匀1 min，超声提取10 min，加入5 g无水硫酸镁，迅速振荡漩涡混匀1min，4000r/min离心5min，取10mL上清液，待净化。

1.3.2样品净化

在固相萃取柱上添加1g无水硫酸钠，用5 mL乙腈活化固相萃取柱，将10 mL待净化的样品溶液上柱，再用10 mL乙腈淋洗，固相萃取装置流速为3 mL/min。收集样液和淋洗液，于35℃条件下旋转蒸发至近干，用5 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈洗脱液（9∶1，V/V）洗脱并定容至2 mL，过膜，待高效液相色谱-串联质谱检测。

1.3.3色谱条件

色谱柱：ThermosyncronicC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；流动相：5mmol/L乙酸铵-甲酸溶液和乙腈溶液梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1　梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4质谱条件

雾化温度650℃；气帘气（氮气）流速：25Psi；喷雾电压：5000V；雾化气流速：65Psi；电喷雾离子源（ESI）（+）正离子模式；多反应监测（multiplereactionmonitoring，MRM）模式；定性定量检测的离子对、去簇电压（declustering potential，DP）、碰撞能（collisionenergy，CE）、碰撞池出口电压（collision cell exit potential，CXP）参数见表2。

表2　氰虫酰胺、氟苯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺的质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of cyantraniliprole，flubendiamide and chloranteraniliprole

1.3.5标准溶液的制备

100 mg/L标准储备溶液的配制：准确称取氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺标准品10.0 mg，分别用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备溶液，于4℃避光贮存。

标准工作溶液的配制：根据需要，临用时吸取一定量的标准储备溶液用5 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈（9∶1，V/V）样品溶解液稀释，配制成适当浓度的标准工作液。

1.3.6定性定量方法

定性方法：对标准工作液及处理好的样液按上述的检测条件进行测定时，如果样液的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；定量方法：根据样液中被测物质的含量，选定质量浓度相近的混合标准工作溶液，对样品溶液进行外标法定量，标准工作溶液和待测样液中目标物质的响应值均应在仪器检测的线性范围内。

2　结果与分析

2.1净化条件的选择

葡萄酒由于基质成分较为复杂，检测时存在较多干扰因素，尤其是一些可溶性色素和甾醇类物质对色谱分离的效果和检测灵敏度有较大影响，因此，前处理过程需对样品进行适当的净化，以提高检测灵敏度。农药残留检测的样品净化方法主要有液液萃取法［12］和固相萃取法［13-14］。其中液液萃取法主要是使用多种溶剂反复萃取，以使样品达到分析要求，该类方法存在操作较为复杂、费时费力、有机溶剂使用量大等缺陷；自动固相萃取技术由于回收率高，溶剂用量少，操作方便等特点，近年来广泛用于食品、饮料以及酒类产品中药物残留的测定［15-16］。本研究对比了PSA柱、C18柱、HLB柱以及GCB/NH2柱的净化效果。结果表明，GCB/NH2柱能有效吸附基质中的甾醇类物质、色素以及酚类和芳香类物质，可将样品中的杂质有效分离，杂峰干扰较少，净化效果最佳。

2.2质谱条件的优化

对化合物的质谱条件进行寻优，母离子主要选择［-H］、［+H］、［+NH4］等3个质量数进行比较。本研究采用正负离子质谱扫描模式，在混合标准溶液质量浓度均为1 mg/L条件下，对氰虫酰胺、氟苯虫酰胺和氯虫苯甲酰胺的质谱条件进行优化。扫描负离子模式，其母离子信号强度均在1×103左右，强度较低，不适合采用；在正离子模式下，分别扫描［+H］和［+NH4］的信号强度，3种物质母离子强度均超过了1×107，但在碎片离子扫描模式下，氰虫酰胺和氯虫苯甲酰胺只有［+H］产生的子离子强度较稳定。因此，经过多方比较，最后选择信号强且稳定的m/z：474.9/285.9、474.9/177.0、483.9/452.9、483.9/285.9、683.0/408.0和683.0/273.9为定性离子对，其中信号较高的m/z：474.9/285.9、483.9/452.9和683.0/408.0为定量离子对。氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的UPLC-MS/MS色谱图见图1。

图1　氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的UPLC-MS/MS色谱图Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of cyantraniliprole，chlorantraniliprole and flubendiamide

2.3方法学考察

2.3.1线性方程和相关系数及测定低限

准确配制双酰胺类系列标准溶液，质量浓度分别为1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L。按照1.3中仪器条件进样分析后，以峰面积（y）为纵坐标，氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的质量浓度（x）为横坐标，绘制工作曲线，结果见表3。由表3可知，3种双酰胺类杀虫剂的线性相关系数R均≥0.999 5，说明在质量浓度1～20 μg/L范围内3种双酰胺类呈良好的线性关系。对空白样品进行加标回收试验，根据信噪比S/N≥10为定量限（limitofquantitation，LOQ）和S/N≥3为检出限（limit of detection，LOD）的参考规定，结合样品处理过程中的稀释倍数，计算各组分的方法检出限分别为0.08 μg/kg、0.29 μg/kg和0.06 μg/kg，定量限分别为0.24 μg/kg、0.94 μg/kg和0.19 μg/kg。

表3　3种双酰胺类杀虫剂的相关系数、线性回归方程、检出限和定量限Table 3 Correlation coefficients，linear regression equations，LOD and LOQ of 3 kinds of diamides insecticides

2.3.2方法的准确度和精密度

以不含氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的葡萄酒样品为空白基质，分别添加3个系列质量浓度的待测物标准溶液，按照1.3节试验方法测定，进行加标回收率试验，重复测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表4。

表4　3种双酰胺类杀虫剂的加标回收率和精密度试验结果（n=6）Table 4 Results of adding standard recovery rate and precision tests of 3 kinds of diamide insecticides（n=6）

由表4可知，以1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg添加水平测定回收率，葡萄酒中3种双酰胺类杀虫剂平均回收率为76.3%～91.1%，RSD为3.9%～9.8%，该方法的准确度较好、精密度较高。

2.4样品的测定

应用本研究所建立的方法对10种葡萄酒样品中3种双酰胺类杀虫剂进行检测，结果表明，有一种样品中检出氰虫酰胺0.12 mg/kg，2种样品检出氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺分别为0.08 mg/kg和0.17 mg/kg，其余葡萄酒样品中均未检出3种双酰胺类杀虫剂。

3　结论

本研究采用固相萃取和UPLC-MS/MS检测技术相结合的方法测定葡萄酒中氰虫酰胺、氟苯虫酰胺和氯虫苯甲酰胺等3种双酰胺类杀虫剂残留量。结果表明，选用GCB/NH2固相萃取柱净化，能有效地将样品中的杂质分离，杂峰干扰较少，净化效果最佳。3种双酰胺类杀虫剂在质量浓度1～20 μg/L范围内呈良好线性关系（R≥0.999 5），分别为0.08μg/kg、0.29μg/kg和0.06μg/kg，定量限分别为0.24μg/kg、0.94 μg/kg和0.19 μg/kg。以1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10 μg/kg添加水平测定平均回收率，范围在76.3%～91.1%，相对标准偏差（RSD）在3.9%～9.8%。表明该方法净化效果好、快速简便、准确度较好、精密度较高，可为葡萄酒样品中3种双酰胺类杀虫剂的同时测定提供参考依据。

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Determination of three kinds of diamides insecticides in wine by UPLC-MS/MS

ZHANG Yun1，CHENG Lijun1，HOU Jie1，CHEN Zeyu1，ZHU Haiyan2
（1.Sanming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Sanming 365000，China；2.School of Resources and Chemical Engineering，Sanming Universtiy，Sanming 365000，China）

The detection method of three kinds of diamides insecticides（including cyantraniliprole，chlorantraniliprole，flubendiamide in wine）residual amount in wine was established by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The three kinds of diamides insecticides in wine was extracted by acetonitrile，and the extracting solution was purified by GCB/NH2solid-phase extraction column，with acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate-methanoic acid as mobile phase，then determined by UPLC-MS/MS after gradient elute.The results showed that three kinds of diamides insecticides had a good linear relationship in the range of 1.2-12.0 μg/ml（R≥0.999 5）.The limit of detection of method was less than 1.0 μg/kg.With 1.0 μg/kg，2.0 μg/kg and 10 μg/kg as adding level，the average recovery rate was 76.3%-91.1%.The relative standard deviation（RSD）was 3.9%-9.8%，which indicated that the method was fast，simple，good purifying effect，good accuracy and high precision，could be applied to the simultaneous determination of three kinds of diamides insecticides in wine.

wine；diamide insecticide；UPLC-MS/MS；determination

O657.7

0254-5071（2016）09-0172-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.039

2016-05-18

国家质检总局科技计划项目（2015IK034）

张云（1984-），男，工程师，硕士，研究方向为食品农兽药残留检测。