衡水老白干酒指纹图谱的单向多元方差分析

姜东明，李泽霞，张福艳，王　敏，张煜行*

（1.河北衡水老白干酒业股份有限公司，河北 衡水 053000；2.河北省白酒酿造工程技术研究中心，河北 衡水 053000；3.衡水学院 生命科学系，河北 衡水 053000）

衡水老白干酒指纹图谱的单向多元方差分析

姜东明1，2，李泽霞1，2，张福艳1，2，王敏3，张煜行1，2*

（1.河北衡水老白干酒业股份有限公司，河北 衡水 053000；2.河北省白酒酿造工程技术研究中心，河北 衡水 053000；3.衡水学院 生命科学系，河北 衡水 053000）

采用HS-SPME-GC-MS联用的方法对衡水老白干酒的8个品种155个样品进行了指纹图谱研究，数据采用单向多元方差分析的方法进行处理。结果表明，建立了8个品种的共有指纹图谱，不同品种之间可以很好的区分，同一酒精度的不同品种也能够得到很好区分。实验结果能够对打击高仿假酒提供科学依据。

衡水老白干酒；指纹图谱；多元方差分析；顶空固相微萃取；气质联用

衡水老白干酒具有悠久的历史，以酒色清澈透明，醇香清雅，酒体谐调，柔和甘爽，回味悠长而著称［1-2］，是中国白酒老白干香型的典型代表［3］。在竞争日趋激烈的白酒市场，如何理性地评价产品质量，在感官品评的基础上，科学地表述产品的个性，这是白酒行业迫切需要解决的问题。指纹图谱可以对成分较复杂的样品进行全面反映，更加有效地体现产品的整体性。目前该技术已经广泛地应用在葡萄酒、中药、橄榄油、果汁、啤酒等行业中［4-8］，用于对原材料、半成品、成品进行品质分析、质量监控等方面。

白酒指纹图谱的分析是借鉴于中药指纹图谱分析的成熟经验［9-11］，大量的研究集中在不同香型的白酒或是不同地域的白酒［12-14］，或是同一厂家生产的白酒［15-17］，并取得了一定的科研成果。如潘凤琴［12］采用顶空进样，结合气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析技术，建立了江西5个不同生产厂家的23个白酒样品的指纹图谱，并运用系统聚类分析及逐步判别分析对白酒的指纹图谱进行了模式识别研究，结果表明，不同厂家生产的白酒其GC-MS指纹图谱既有较好的相关性，又存在一定差异，且系统聚类分析及逐步判别分析均能对样品进行正确分类，判别函数回判准确率为100%，从而建立了识别不同厂家白酒的方法。孙其然等［16］对贵州茅台酒的GC-MS指纹图谱进行了分析，建立了贵州茅台酒模板指纹图谱，发现采用“夹角余弦法”的“指纹图谱相似度计算软件”能区分贵州茅台酒和其他不同酒精度、不同香型的白酒，但对相同酒精度、同样香型白酒的区分度明显不够，需要结合其特征峰的数量进行综合判断。白酒受地域和气候的影响非常大，因而不同地域不同香型的区分相对容易一些，对于同一生产厂家生产的不同品种特别是相同酒精度的品种进行良好区分的文献未见报道。本文利用顶空固相微萃取-气质联用（headspace-solid phase microex-traction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法得到的指纹图谱，采用单因素方差分析的方法对8个品种的155个衡水老白干酒样品进行了分析，以期得到衡水老白干酒的共有指纹图谱，区分不同品种和相同酒精度不同品种的衡水老白干酒。

1　材料与方法［2，18］

1.1材料与试剂

8个不同品种老白干成品酒（编号A-H，A品种23个样品，B品种20个样品，C品种17个样品，D品种31个样品，E品种13个样品，F品种13个样品，G品种26个样品，H品种12个样品，共计155个样品，其中品种A和C酒精度相同，A-E取自南厂区，F-G取自北厂区）：衡水老白干酒业股份有限公司。

NaCl、乙酸正戊酯、无水乙醇（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

AgilentGC7890A-5975C&MSD气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；50/30DVD/CVB/PMDS萃取头（2 μm）：美国Supelco公司；CombiPAL进样器：瑞士CTC公司；IKA vortex3漩涡混合器：德国IKA公司；Eppendorf移液器：德国艾本德公司。

1.3实验方法

1.3.1样品处理方法

内标液：准确吸取2 mL乙酸正戊酯，用体积分数60%的乙醇定容至100 mL，配制成体积分数2%的内标溶液；酒样：样品稀释到10%vol，移取5.0 mL装入20 mL顶空瓶，再加入2.5 g NaCl；酒样溶液制备：吸取10 μL内标溶液于5 mL白酒中，在IKA vortex3涡旋混合器上混合1 min。

1.3.2微萃取法操作步骤

CTC萃取条件：50℃、250 r/min条件下孵化5 min，插入50/30DVD/CVB/PMDS萃取头萃取6 min，然后在250℃条件下在进样口解吸6 min，以上操作由CTC进样器自动操作运行。

1.3.3GC-MS分析条件

气相色谱条件：色谱柱CP-Wax57CB（50 m×0，25 mm× 0.2 μm）；柱温40℃，以2℃/min升至100℃，然后以4℃/min升至200℃保持3 min，总运行时间约58 min；载气：高纯氦气（纯度99.999%）；流速：1.2 mL/min；进样口温度：250℃；不分流进样。

质谱条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；全扫描模式，扫描范围29～450amu。

1.3.4定性定量方法

定性方法：以美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11谱库检索为主，同时结合人工解析质谱图；计算分离出的挥发性成分的保留指数（retention index，RI），并与文献值进行对比。保留指数按照参考文献的方法计算。

定量方法：内标法。

1.3.5指纹图谱处理方法

采用ChemPatternTM化学计量学软件。

2　结果与分析

2.1方法学考察［18］

2.1.1仪器精密度实验

取同一批次白酒1份，按1.3方法制备样品并连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计。实验结果表明，TIC图中各色谱峰相对保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）＜0.10%，各色谱峰相对峰面积的RSD＜5%，表明仪器精密度良好。

2.1.2方法重复性实验

取同一批次白酒1份，按1.3方法制备酒样溶液并按实验条件测定，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计。实验结果表明，TIC图中各色谱峰相对保留时间RSD＜0.1%，各色谱峰相对峰面积的RSD＜5%，表明该实验方法的重现性良好。

2.1.3样品溶液稳定性实验

取同一批次白酒1份，按1.3方法制备酒样溶液，并按实验条件分别在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行测定，其中各色谱峰相对保留时间RSD＜0.15%，相对峰面积的RSD＜3.5%，表明酒样在24 h内保持稳定。

2.2单因素方差分析

样品的积分参数：平滑窗口0，斜率55，最小峰宽0，最小峰高0，最小相对峰高0.01，最小峰面积0，最小相对峰面积0.05，通过上述参数的设置过滤掉极小的色谱峰，通过手动的方法去除掉萃取头和柱流失的色谱峰，通过保留时间校正（手动+自动）使各谱峰匹配。

2.3共有指纹图谱的建立

图1　衡水老白干挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograph of volatile components o Hengshui LaobaiganBaijiu

在chemmindTM软件共有模式的生成参数：共有峰的来源（峰面积）；共有峰统计值（均数）；共有峰的筛选（25%，低四分位数）；最小共有峰值（0.1%）；谱图模拟方法（平均色谱图）；数据的预处理（均一化，观测）。从而得到8个品种衡水老白干挥发性成分GC-MS总离子流色谱图见图1，分析鉴定结果见表1。

由表1可知，155个样品的指纹图谱中共有色谱峰为111个，这对于区分同一工厂及相同酒精度的白酒将具有重大意义。

表1　衡水老干白共有指纹图谱色谱峰Table 1 Common fingerprint peaks in Hengshui LaobaiganBaijiu

2.4单向多元方差分析

155个样品每个含有111个色谱峰信息，提供的数据是巨大的，常规的分析不能得出有益的结论，借助大数据处理软件，可以得到很好的结果。在ChemPatternTM化学计量软件中多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）在化学计量学中用于寻找分组间差异最大化的一组自变量的线性组合，自变量线性组合后形成的新变量称为典型变量（canonical variable，CV），主要用于寻找组间差异。利用该软件对衡水老白干酒8个品种的155个样品进行单向多元方差分析，结果见图2。

图2　衡水老白干酒8个品种的单向多元方差分析结果Fig.2 One-way multivariate analysis of variance results of eight types of Hengshui LaobaiganBaijiu

从图2可以看出，8个品种的酒样得到了一个良好的区分，同一酒精度的品种A和C也能够很好区分。

3　结论

利用HS-SPME-GC-MS分析衡水老白干酒的不同品种，得到了衡水老白干酒的共有指纹图谱，并对8个不同的品种有良好的区分，而且对于同一酒精度的两个品种衡水老白干酒也能够很好的区分。该方法对于质量控制特别是打击市场上高仿的衡水老白干酒具有支持作用。

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One-way multivariate analysis of variance on Hengshui LaobaiganBaijiufingerprint

JIANG Dongming1，2，LI Zexia1，2，ZHANG Fuyan1，2，WAN Min3，ZHANG Yuhang1，2*
（1.Hebei Hengshui Laobaigan Liquor-making（group）Co.，Ltd.，Hengshui 053000，China；2.Hebei Liquor-making Engineering Center，Hengshui 053000，China；3.College of Life Science，Hengshui University，Hengshui 053000，China）

Fingerprints of 155 samples of eight types of Hengshui LaobaiganBaijiuwere studied by HS-SPME-GC-MS，and then datas were treated with one-way multivariate variance analysis method.The results showed that a common fingerprint was established on eight types of theBaijiu，different types of theBaijiucan be distinguished well；and different types of theBaijiuwith same alcohol content can also be distinguished well.The experimental results can provide a scientific basis against fake Hengshui LaobaiganBaijiu.

Hengshui LaobaiganBaijiu；fingerprint；multivariate analysis of variance；HS-SPME；GC-MS

TS262.3；TS261.7

0254-5071（2016）09-0134-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.030

2016-04-22

姜东明（1970-），男，工程师，本科，主要从事白酒风味化学的研究工作。

张煜行（1967-），男，高级工程师，硕士，主要从事白酒酿造工作。