ERCC1基因多态性与肝癌患者易感性分析*

李艳秋，赵惠柳，欧　超，李美琴，利基林，朱　波

(广西医科大学附属肿瘤医院检验科，南宁 530021)



·论著·

ERCC1基因多态性与肝癌患者易感性分析*

李艳秋，赵惠柳#，欧超，李美琴，利基林，朱波△

(广西医科大学附属肿瘤医院检验科，南宁 530021)

目的探讨切除修复交叉互补基因1(ERCC1)-4533/8092位点单核苷酸多态性(SNPs)与广西壮族人群肝癌易感性之间关系。方法通过聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测88例原发性肝癌患者和82例健康对照者的ERCC1-4533/8092基因多态性。结果ERCC1-4533位点的基因分型在病例组和对照组的频数分布差异无统计学意义(P>0.05)，ERCC1-8092位点的基因分型在病例组和对照组的频数分布差异具有统计学意义(P<0.05)。与携带ERCC1-8092 CC基因型的个体相比，携带ERCC1-C8092 CA/AA基因型的个体具有更高的肝癌易感性(CA：OR=2.556，95%CI：1.345～4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以携带ERCC1-8092 C等位基因作为参照，携带ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原发性肝癌的发病危险性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。结论ERCC1-8092位点基因多态性与广西壮族人群肝癌易感性有关。

ERCC1；原发性肝癌；基因多态性；易感性

原发性肝癌的发生发展是1个长期并且复杂的过程，原发性肝癌不但是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤，且初期的临床症状不明显，因此很多患者在确诊的时候已经处于原发性肝癌晚期，只有30%患者通过如手术切除、肝移植、经皮消融等方法治愈。近年在我国发病率呈上升趋势，因此原发性肝癌的早期诊断变得越来越重要[1-2]。许多研究表明，基因多态性可能和某些DNA修复基因的功能有关，这些不同的基因多态性可能与不同癌症的易感性有关，所以，分子水平的疾病诊断可能对肿瘤的早期诊断及肿瘤的个性化治疗和预后判断做出一定的贡献[2]。切除修复交叉互补基因1(ERCC1)是核苷酸切除修复途径(NER)的关键酶，其与特异性核酸内切酶DNA修复缺乏互补酶F(XPF)结合形成异源性二聚体结构，具有识别损伤并切除5′端的双重作用[3-4]。有研究表明，ERCC1基因多态性可以影响核苷酸切除修复过程使其功能异常，基因组的不稳定性增加，这可能导致多种肿瘤发生[5]。因此，本研究将对ERCC1-4533/8092的多态性与广西壮族人群的原发性肝癌易感性之间的关系进行探讨。

1　资料与方法

1.1一般资料病例组选取2015年7～12月在本院病理组织学及影像学确诊未经治疗的原发性肝细胞癌88例，其中女16例，男72例；平均年龄(51.375±11.243)岁。对照组选自同医院同期住院的非肿瘤患者82例(临床检查、检验结果均无异常)，其中，女15例，男67例；平均年龄(53.341±15.912)岁。病例组和对照组在年龄和性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有入选研究对象均为广西壮族人。

1.2仪器与试剂小量全血基因组DNA快速提取试剂盒、dNTPs由北京艾德莱生物科技有限公司提供；Taq DNA聚合酶、PmaCⅠ、Mbo Ⅱ由日本TaKaRa公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司合成；琼脂糖由西班牙Biowest公司提供；ProFlex PCR仪(美国Life Techonlogies公司)；Universal Hood Ⅲ凝胶成像系统(美国Bio-rad公司)；DYCP-31DN电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1全血DNA提取抽取受检者外周静脉血2～3 mL置于EDTA 抗凝管中，按照试剂盒说明书严格操作，使用小量全血基因组DNA快速提取试剂盒提取标本中的DNA。经核酸浓度测定仪测量浓度后，A260/A280比值在1.8～2.0视为DNA纯度合格，储存于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2ERCC1 4533/8092位点基因多态性分析采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对ERCC1-4533/8092位点基因多态性进行分析。PCR反应体系共25 μL，含5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，灭菌双蒸水17 μL。引物设计参考文献[6-7]。4533位点：上游引物：5′-AGA TGT CCT CTG CTC ACC CC-3′，下游引物：5′-GGG AGA ACA AAG TGG CTG GA-3′，PCR反应过程为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃再延伸10 min。目的产物长379 bp。8092位点：上游引物：5′-ACA GTG CCC CAA GAG GAG AT-3′，下游引物：5′-AGT CTC TGG GGA GGG ATT CT-3′，PCR反应过程为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃再延伸10 min，目的产物长204 bp。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后在紫外线灯下确认为目的条带，取10 μL扩增产物分别与10 U限制性内切酶PmaCⅠ(ERCC1-4533)/Mbo Ⅱ(ERCC1-8092)混匀后置于37 ℃水浴箱中过夜进行酶切反应。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳后在紫外线灯下分析结果。为保证基因多态性分型的准确性，随机抽取20%的标本进行重复试验，结果与第1次试验一致。

1.4统计学处理以t检验和χ2检验统计分别分析计量资料和计数资料。对照组ERCC1-4533/8092基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验。应用非条件Logistic回归计算ERCC1-4533/8092基因型分布的比值比(OR)及其95%可信区间(95%CI)评价不同基因型和等位基因与肝癌易感性之间的相关性。所有统计检验均为双侧检验，当P<0.05时认为差异具有统计学意义。采用SPSS17.0统计软件录入和分析数据。

2　结　　果

2.1ERCC1-4533/8092位点的PCR扩增产物及酶切产物分析ERCC1-4533位点PCR扩增产物片段大小为379 bp，经限制性内切酶PmaC Ⅰ酶切后可出现3种情况。基因型为纯合子GG时电泳结果出现174、205 bp 2条带，基因型为杂合子GA时电泳结果出现74、205、379 bp 3条带，基因型为纯合子AA时电泳结果出现379 bp 1条带。ERCC1-8092位点PCR扩增产物片段大小为204 bp，经限制性内切酶Mbo Ⅱ酶切后可出现3种情况。基因型为纯合子CC时电泳结果出现204 bp 1条带，基因型为杂合子CA时电泳结果出现204、116、88 bp 3条带，基因型为纯合子AA时电泳结果出现116、88 bp 2条带。见图1、2。

2.2Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验为了检验ERCC1-4533/8092位点基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，对对照组的ERCC1-4533/8092位点基因型分布进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，检验结果显示，对照组的ERCC1-4533/8092位点基因型分布的观察数和预期数之间的差异无统计学意义(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，对照组标本具有群体代表性。见表1。

2.3ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布频率比较和肝癌易感性分析ERCC1-4533位点的基因分型的频数分布在病例组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)，ERCC1-8092位点的基因分型的频数分布在病例组和对照组两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。经非条件Logistic回归分析，以ERCC1-8092 CC基因型作为参照，ERCC1-C8092 CA基因型可以增加原发性肝癌的发病危险性(OR=2.556，95%CI：1.345～4.855)，ERCC1-C8092 AA基因型可以增加原发性肝癌的发病危险性(OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以ERCC1-8092 C等位基因作为参照，ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原发性肝癌的发病危险性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。见表2。

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-4533 PCR扩增产物；2表示纯合子AA基因型：379 bp；3表示杂合子GA 基因型：174、205、379 bp；4表示纯合子GG基因型：174、205 bp。

图1ERCC1-4533基因多态性2%琼脂糖凝胶电泳结果分析

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-8092 PCR扩增产物；2表示纯合子AA基因型：116、88 bp；3表示杂合子CA基因型：204、116、88 bp；4表示纯合子CC基因型：204 bp。

图2　ERCC1-8092基因多态性2%

表2　　病例组与对照组ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布频率比较

续表2　　病例组与对照组ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布频率比较

注：与对照组相比，*P>0.05，#P<0.05。

3　讨　　论

正常细胞主要通过核苷酸切除修复途径(NER)进行DNA损伤修复，而ERCC1是核苷酸切除修复途径中的关键基因。ERCC1基因最初是由HeLa细胞克隆得到，位于人类第19号(19q13.2-3)染色体上，编码含297个氨基酸的ERCC1蛋白[8-9]。单核苷酸多态性(SNPs)是指基因水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1%[10]。ERCC1基因多态性可能影响ERCC1 mRNA表达或稳定及蛋白质功能，可能使核苷酸切除修复途径功能受影响，导致基因组的不稳定性增加，进而产生肿瘤或其他疾病发生的恶性表型行为。有研究表明，ERCC1基因多态性与非小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤的发病机制、对铂类等抗肿瘤药物的反应性及预后有密切关系[11-13]。

目前关于ERCC1-4533/8092位点基因多态性与原发性肝癌易感性关系的报道还比较少，其位点是否存在多态性且与原发性肝癌易感性是否有关尚不能确定。蓝永洪等[8]的研究表明，海南人群中人类ERCC1-4533G/A存在多态性。郑霄雁[14]的研究结果显示， ERCC1-4533/8092位点存在基因多态性，并且这2个位点基因多态性均与原发性肝癌的发生可能有关。在本次病例对照研究中，作者分析了ERCC1-4533/8092 2个位点基因多态性与广西壮族人群原发性肝癌易感性之间的关系，结果表明ERCC1-4533位点的基因分型的频数分布在病例组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，ERCC1-8092位点的基因分型和等位基因的频数分布在病例组和对照组两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。非条件Logistic回归分析结果显示，ERCC1-8092位点的A等位基因可能是广西壮族人群原发性肝癌发生的危险因素，携带ERCC1-8092 A等位基因的个体患原发性肝癌的危险性是ERCC1-8092 C等位基因的2.387倍(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。然而，由于本次研究收集的对象数量偏少并仅限于广西壮族人群且只针对原发性肝癌这1种肿瘤进行探讨，因此，ERCC1-4533/8092基因多态性是否对原发性肝癌的易感性产生影响，是否与肝脏其他相关性疾病有关，需进一步扩大样本数量，扩大疾病范围，在不同地区、不同人群中进行更深一步的探讨。

原发性肝癌在世界肿瘤相关死亡中排名第2位，有数据显示目前中国发病人数约占全球的原发性肝癌50%[15]。广西是中国原发性肝癌的高发区，同时也是壮族人群聚集地[16]。而ERCC1基因多态性又与铂类化疗药物的耐药性有关，因此对广西壮族人群的ERCC1基因多态性进行研究将对原发性肝癌的发病机制、基因水平的疾病诊断和个性化治疗及预后判断具有重要意义。

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The relationship on polymorphisms of ERCC1-4533/8092 and the susceptibility of hepatocellular carcinoma*

LIYanqiu，ZHAOHuiliu#，OUChao，LIMeiqin，LIJilin，ZHUBo△

(DepartmentofLaboratory，AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China)

ObjectiveTo investigate the relationship on the excision repair cross complementing gene 1(ERCC1)-4533/8092 site single nucleotide polymorphisms(SNPs) and the susceptibility to hepatocellular carcinoma(HCC) in Guangxi Zhuang population.MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) method was used to detect the ERCC1-4533/8092 gene polymorphism in 88 cases with primary liver cancer and 82 cases of normal controls.ResultsThere was no difference in the frequency distribution of ERCC1-4533 in the case group and the control group,the frequency distribution of the ERCC1-8092 in the case group and the control group was different(P<0.05).Compared with ERCC1-8092 CC，ERCC1-C8092 CA/AA had higher risk of primary hepatocellular carcinoma(CA：OR=2.556，95%CI：1.345-4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000-75.092).ERCC1-8092 C allele as a reference，ERCC1-8092 A allele can increase the risk of primary liver cancer(OR=2.387，95%CI：1.428-3.992).ConclusionThe genetic polymorphisms of ERCC1-8092 sites are associated with susceptibility to hepatocellular carcinoma in Guangxi Zhuang population.

ERCC1；primary hepatocellular carcinoma；polymorphisms；susceptibility

广西自然科学基金资助项目(2012GXNSFAA053170)。

李艳秋，女，广西医科大学在读研究生，主要从事血清肿瘤标志物检验、肿瘤基金分型等方面的研究。#共同第一作者：赵惠柳，女，副主任技师，主要从事肿瘤的诊断、发生、发展等方面的研究。△

，E-mail：bozhu196@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.007

A

1673-4130(2016)18-2523-03

2016-04-03

2016-06-11)