祛痰通络汤对糖尿病肾病大鼠肾组织内质网应激的影响*

王丽华刘丽秋杨鹏鹏王福荣于俊生郑　燕李平海李淑秀

（1.青岛大学附属海慈医院，山东　青岛266003；2.青岛大学附属医院，山东　青岛266000；3.中国人民解放军91286部队门诊部，山东　青岛266000）

祛痰通络汤对糖尿病肾病大鼠肾组织内质网应激的影响*

王丽华1刘丽秋2△杨鹏鹏2王福荣1于俊生1郑燕1李平海3李淑秀1

（1.青岛大学附属海慈医院，山东青岛266003；2.青岛大学附属医院，山东青岛266000；3.中国人民解放军91286部队门诊部，山东青岛266000）

目的观察祛痰通络汤对糖尿病肾病大鼠肾组织中内质网应激相关蛋白GRP78，Caspase12的影响。方法高糖高脂饲料联合腹腔注射STZ制备糖尿病肾病模型，随机分为正常对照组、模型组、祛痰通络汤组、四苯基丁酸组，干预8周。观察各组24 h尿蛋白定量、肌酐、肾脏病理学变化；免疫组化和Western blot检测肾组织内质网应激相关蛋白GRP78，Caspase-12的表达。结果经过祛痰通络汤治疗后，大鼠体质量上升，24 h尿蛋白定量、糖化血红蛋白、肌酐下降；病理改变减轻；模型组肾组织的GRP78、Caspase12表达明显升高；祛痰通络汤组GRP78、Caspase-12表达明显降低（均P＜0.05）。结论糖尿病肾病大鼠肾脏中内质网应激反应明显增强，祛痰通络汤降低内质网应激，可能是其肾脏保护作用的重要机制。

糖尿病肾病祛痰通络汤内质网应激

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Qutan Tongluo Decoction on the expression of endoplasmic reticulum stress-related molecules GRP78 and Caspase12 in renal of diabetic nephropathy rats.M ethods：The diabetic nephropathy ratmodelwas induced by feeding high-glucose high-fat diet in combination with intraperitoneal injection of STZ.Wistar rats were random ly divided into 4 groups：the normal control group，the model group，Qutan Tongluo Decoction group，and 4-phenyl butyric acid treatment（PBA group）.At the end of 8 weeks，24-hour urinary protein excretion，serum creatinine（Scr）and renal pathological changeswere determined；the expression of glucose-regulated protein 78（GRP78）and Caspase-12 were examined by immunohistochemistry and western blotting respectively.Results：Qutan Tongluo Decoction treatment raised bodymass of rats，reduced 24-hour urinary protein excretion，glycosylated hemoglobin，and serum creatinine，and relieved pathological changes. The expressions of GRP78 and Caspase12 proteins in themodel group was significantly higher；The expressions of GRP78 and Caspase12 proteins in Qutan Tongluo Decoction group dropped significantly（P＜0.05）.Conclusion：Endoplasmic reticulum stress is abundantly expressed in the kidneys of diabetic nephropathy rats.Qutan Tongluo Decoction decreases ER stress，whichmay be an importantmechanism in renal protective effects.

【Key words】Diabetic nephropathy；Qutan Tongluo Decoction；Endoplasmic reticulum stress

糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症，是导致终末期肾病（ESRD）的重要原因，发展为ESRD的比例高达20%～40%［1］，目前其发病机制尚未完全阐明，缺乏有效的治疗手段。多数人认为肾脏血流动力学改变、血糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱是糖尿病肾病的病变基础。目前越来越多的证据表明［2］，持续高糖和蛋白尿诱导内质网应激，内质网应激是糖尿病肾脏病的重要发病机制［1］。“脾肾气虚，痰瘀阻络”是糖尿病肾病的重要病机，为此拟定了以祛痰通络法为主的中药复方，我们前期研究已明确其降低尿蛋白，具有保护足细胞、改善糖尿病早期肾脏损伤的作用［3］，而其机制仍不十分明确。本研究观察祛痰通络汤对糖尿病大鼠肾组织中内质网应激的影响，为糖尿病肾病的治疗提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物50只成年雄性Wistar大鼠，8周龄，体质量200～220 g［由青岛市动物研究所提供，动物许可证号SCXK（鲁）201300001］。室温23～25℃，湿度40%～60%，12 h交替照明，大鼠自由进食和饮水。

1.2试药与仪器祛痰通络汤组成：当归12 g，川芎12 g，赤芍12 g，白术15 g，土茯苓30 g，制大黄10 g，瓦楞子30 g，僵蚕30 g，海藻15 g，葫芦巴15 g。由青岛市中医医院制剂室制成灭菌浓煎密封制剂，药物相对密度为1.0 g/L，生药含量为1.5 g/mL。链脲佐菌素（STZ）、4-苯基丁酸（4-PBA）（美国Sigma公司）；兔抗鼠GRP78抗体，兔抗鼠Caspase-12抗体（abcam公司）；PV-9000二步法免疫组化试剂（北京中杉生物技术有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天公司）。全自动生化分析仪（日本olympus AU640）；RM2135型石蜡切片机（LEICA，美国）；显微BMJ-Ⅲ型病理组织包埋冷冻台（常州中威电子仪器厂）；凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.3分组与造模50只成年雄性Wistar大鼠，适应性喂养1周后，按随机数字表法抽取10只为正常对照组，余40只建立糖尿病肾病大鼠模型。正常对照组予以普通颗粒饲料喂养；其余大鼠均予高糖高脂饲料喂养，喂养8周后，禁食12 h，将STZ溶于0.1mmol/L的枸橼酸缓冲液（pH 4.3）中，腹腔注射STZ 30 mg/kg，72 h后尾静脉取血，检测血糖≥16.7 mmol/L，为糖尿病大鼠造模成功［1］。造模同时，正常对照组给予等体积0.1mmol/L的枸橼酸缓冲液腹腔注射。40只造模大鼠中，2只大鼠血糖不符合糖尿病诊断标准被剔除，死亡4只。继续高糖高脂饲料喂养6周，4只大鼠不符合糖尿病肾病标准（24 h尿蛋白定量大于20μg/min）被剔除，余30只糖尿病肾病大鼠随机分为模型组（10只）、祛痰通络汤组（10只）、4-PBA组（10只）。

1.4干预措施祛痰通络汤组大鼠按2 mL/100 g剂量灌胃，4-PBA组大鼠按1 g/kg的剂量每日灌胃，治疗8周。正常对照组和模型组予等量生理盐水灌胃。干预过程中模型组、祛痰通络汤组、4-PBA组大鼠各死亡2只。

1.5标本采集与检测1）24 h尿量白定量：第8周末，收集各组大鼠第8周末的24 h尿液，ELISA法检测24 h尿蛋白定量。各组大鼠禁食12 h，处死取材，具体如下：以10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔麻醉试验大鼠，腹主动脉取血6 mL，分别置于EDTA抗凝管3 mL检测糖化血红蛋白和促凝管内3mL检测肌酐。2）免疫组化检测：大鼠血液采集后，取出双侧肾脏，生理盐水洗净，左右肾各取1/2放入10%甲醛中固定，作免疫组织化学检测。采用SP法。2μm肾组织切片，常规脱蜡至水，一抗GRP78（1∶200），CHOP（1∶100）稀释，PBS代替一抗作阴性对照，DAB染色，显微镜控制下显色，棕黄色颗粒为阳性。3）Western blot检测：剩余1/2肾脏放入EP管置于-80℃保存，行Western blot检测。内质网应激相关蛋白GRP78，Caspase12的表达。取-80℃保存肾脏组织，提取并测定蛋白含量；取样品加入loading buffer，配制SDS-PAGE胶，取样品上样蛋白20μg，100 V电泳；0.22μm PVDF膜（甲醛处理），40 min，脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗（1∶1000），4℃过夜，TBST清洗3次，每次5 min；加入二抗（1∶30000），室温1 h，TBST清洗3次，每次5min，显影，所得结果以内参GAPDH校正。

1.5统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（表示，成组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠一般状况比较见表1。模型组大鼠出现典型的多饮、多尿、多食、体质量减轻等糖尿病症状，毛色暗淡，血糖持续≥16.7 mmol/L。祛痰通络汤组大鼠体质量增加最多，明显高于模型组（P＜0.05），祛痰通络汤组与4-PBA组大鼠体质量相比，无明显差别（P＞0.05）。与正常对照组相比，模型组糖化血红蛋白、肌酐水平明显升高（P＜0.05）；祛痰通络汤组的肌酐较模型组明显下降（P＜0.05），与4-PBA组相比差异无统计学意义（P＞0.05），4-PBA组糖化血红蛋白较模型组及祛痰通络汤组明显下降（P＜0.05）。

表1　各组大鼠一般情况比较（

表1　各组大鼠一般情况比较（

与正常对照组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与4-PBA组比较，△P＜0.05。下同。

组别n肌酐（μmol/L）体质量（g）　糖化血红蛋白（%）正常对照组10 23.8±2.56模型组8 55.9±5.7▲祛痰通络汤组8 34.6±4.38▲*427.18±9.56*2.62±0.33 370.04±12.27 6.97±0.65▲434.54±9.38*6.60±0.31▲△4-PBA组8 31.9±2.27▲*425.60±7.27*4.67±0.58▲*

2.2各组大鼠干预前后24 h尿蛋白定量比较见表2。治疗前，模型组、祛瘀通络汤组及4-PBA组的24 h尿蛋白定量较正常对照组明显升高（P＜0.05），模型组及治疗组的24 h尿蛋白定量无明显差别（P＞0.05）。治疗8周后，祛痰通络汤组24 h尿蛋白量较模型组明显下降（P＜0.05），与4-PBA组相比无明显差别（P＞0.05），正常对照组的24 h尿蛋白定量无明显变化（P＞0.05）。

表2　各组大鼠干预前后24 h尿蛋白定量比较（μg/min，

表2　各组大鼠干预前后24 h尿蛋白定量比较（μg/min，

组别n干预前　干预后正常对照组10 3.70±0.56 3.72±0.41模型组8 20.58±2.31▲26.35±7.31▲祛痰通络汤组8 21.48±2.48▲16.78±3.65▲*4-PBA组8 20.31±3.68▲17.19±2.29▲*

2.3各组干预后GRP78、Caspase12免疫组化结果见图1，图2。在正常对照组，GRP78在肾小管上皮细胞中少量表达；模型组肾小管表达显著增多，肾小球呈阳性表达；祛痰通络汤组及4-PBA组肾小球及肾小管表达明显低于模型组。Caspase12主要位于肾小管上皮细胞内，正常对照组表达弱，模型组表达明显增强（P＜0.05），祛痰通络汤组及4-PBA组较模型组明显降低（P＜0.05）。祛痰通络汤组与4-PBA组相比无明显差别。

图1　各组大鼠第8周GRP78免疫组化图片（DAB染色）

图2　各组大鼠第8周Caspase12免疫组化图片（DAB染色）

2.4各组干预后Western blot检测结果比较见表3，图3。与正常对照组相比，模型组GRP78、Caspase12表达明显升高（P＜0.05）。祛痰通络汤治疗后，GRP78蛋白及Caspase12蛋白表达较模型组明显降低（P＜0.05）。祛痰通络汤组与4-PBA组相比无明显差别。

3　讨　论

越来越多的证据表明，内质网应激可能是肾脏发病的一个重要机制。内质网应激与肾小球疾病的蛋白尿有关［4］；糖尿病肾病中，PERK/eIF2α和IRE1/JNK途径被激活，内质网应激反应上调［5］。内质网应激主要通过激活内质网上的3种跨膜蛋白：双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶、活化转录因子6和跨膜蛋白激酶1［6］，这3种膜蛋白也被称为内质网感受器［7］。正常情况下，与内质网葡萄糖调节蛋白78（GRP78）结合，处于无活性状态，当未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔蓄积时，这3种蛋白可与GRP78解离，下游的信号通路被激活。

表3　各组大鼠第8周末GRP78，Caspase12蛋白表达比较（

表3　各组大鼠第8周末GRP78，Caspase12蛋白表达比较（

组　别n GRP78/GAPDH Caspase12/GAPDH正常对照组10 0.30±0.03 0.24±0.05模型组8 1.04±0.20▲0.84±0.20▲祛痰通络汤组8 0.46±0.11▲*0.51±0.11▲*4-PBA组8 0.47±0.08▲*0.52±0.10▲*

图3　各组干预后GRP78，Caspase12蛋白表达电泳图

GRP78［8］又称免疫球蛋白重链结合蛋白，是热休克蛋白70 kDa家族成员之一，是内质网中重要的分子伴侣，帮助蛋白质的折叠和成熟，其表达增高是内质网应激发生和存在的标志［9］。Fukami等［10］发现，AGEs引起大鼠足细胞GPR78表达上调，通过一系列反应诱导内质网应激，最终导致足细胞凋亡。Chen等［11］对糖尿病肾病小鼠的研究发现，小鼠肾组织GRP78水平及尿蛋白水平显著增高，并伴有显著肾小球硬化，与我们的研究一致。Caspase-12属于半胱天冬酶家族，位于内质网外膜，是介导内质网应激凋亡的关键蛋白酶，是内质网应激诱导细胞凋亡特有的［12］。Marie L等［13］发现20周龄糖尿病db/db小鼠近端小管Caspase-12的mRNA表达明显升高，蛋白表达上调。本研究发现糖尿病肾病大鼠模型组Caspase-12蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），其分布范围和表达强度明显高于正常对照组。祛痰通络汤可降低Caspase-12蛋白表达水平。

中医学认为本病多属于“消渴”“水肿”“尿浊”“胀满”“癃闭”“关格”的范畴。糖尿病肾病与“痰瘀”有密切关系，痰瘀是糖尿病肾病进展过程中的必然产物［14］，并形成恶性循环，影响肾的气血运行和津液输布。消渴日久，缠绵不愈，毒邪入络，伏藏不去，毒自内生，损害肾脏，络脉瘀阻，故拟定祛痰通络汤以活血通络治疗。该方由当归芍药散为基础方加减而来，以当归、川芎、赤芍活血通络为君，以瓦楞子、僵蚕、海藻消痰软坚，白术健补脾气，葫芦巴温肾祛湿，共为臣药，佐以赤芍除血痹，破坚积；大黄、土茯苓解毒排毒，泄浊通络。以通为补，祛邪为务，缓攻缓补，使泄而不伤正，补而不滞邪，共奏祛痰通络、邪祛正安之功效。

本研究应用高糖高脂饲料联合腹腔注射STZ制备糖尿病肾病模型，随机分为正常对照组、模型组、祛痰通络汤组、4-PBA组。4-PBA酸能够稳定蛋白构象，改善内质网折叠能力，降低内质网应激，目前已广泛用于动物模型［15-16］。我们应用免疫组化和Western blot对糖尿病肾病大鼠的内质网应激相关分子研究，发现模型组GRP78蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），提示糖尿病肾病大鼠肾组织内质网应激发生，4-PBA抑制内质网应激，改善肾功能，降低尿蛋白，与以往的研究一致。祛痰通络汤治疗后，GRP78水平较模型组明显降低（P＜0.05），说明祛痰通络汤能够改善糖尿病肾病内质网应激，免疫组化与Western-blot的研究结果一致，与以往的研究一致［17］；模型组Caspase-12的表达明显增强（P＜0.05），祛痰通络汤干预后，其蛋白表达明显降低（P＜0.05）；治疗前，模型组及治疗组的24 h尿蛋白定量较对照组明显升高，治疗8周后，祛痰通络汤组24 h尿蛋白量较模型组明显下降（P＜0.05）。

本研究发现祛痰通络汤能够降低尿蛋白，改善肾功能指标，降低内质网应激相关蛋白GRP78、Caspase12的表达，说明祛痰通络汤可以减轻糖尿病肾病大鼠肾组织中的内质网应激，延缓糖尿病肾病大鼠肾功能的进展。

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Effect of Qutan Tongluo Decoction on Protein Expression of Endoplasm ic Reticulum Stress in Renal of Diabetic Nephropathy Rats

WANG Lihua，LIU Liqiu，YANG Pengpeng，et al.Haici Hospital Affiliated of Qingdao University，Shandong，Qingdao 266003，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1667-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.007

2016-05-12）

山东省青岛市中医局计划项目（2015-ZYY005）

（电子邮箱：liuliqiu@medmail.com.cn）