加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织ADRP、PPAR-γ和Sir 2蛋白表达的影响*

晁　旭王越月杜　静赵家荣安庆玲李磊磊

（1.陕西中医药大学基础医学院，陕西　咸阳712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西咸阳71200）

·研究报告·

加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织ADRP、PPAR-γ和Sir 2蛋白表达的影响*

晁旭1，2王越月2杜静2赵家荣1安庆玲1李磊磊1

（1.陕西中医药大学基础医学院，陕西咸阳712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西咸阳71200）

目的研究加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织脂肪分化相关蛋白（ADRP）、过氧化物酶体增殖活化物受体γ（PPAR-γ）和沉默信息调控子2（Sir2）蛋白表达的影响。方法SD雄性大鼠60只，随机分为6组，每组10只。50只给予含乙醇灌胃，同时饲喂高脂饲料，制备酒精性脂肪肝模型。实验组动物给予不同剂量的加味苓桂术甘灌胃6周。然后采用生化分析仪检测血样中总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、脂肪酸（FFA）的含量；利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）技术，检测酒精性脂肪肝大鼠模型肝脏组织中ADRP、PPAR-γ和Sir2的mRNA和蛋白表达。结果与模型组相比，给药6周后加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组大鼠血清中TG、CHOL和FFA水平均有明显下降（P＜0.05）；加味苓桂术甘方可显著下调肝脏组织中ADRP、PPAR-γ的表达，而上调Sir2的表达。结论加味苓桂术甘方可通过改变肝脏组织ADRP、PPAR-γ和Sir2的表达，从而抑制酒精性脂肪肝的发生。

酒精性脂肪加味苓桂术甘方ADRP PPAR-γSir2

【Abstract】Objective：To study effects of Jiawei Linggui Zhugan Decoction on expression of ADRP，PPAR-γ and Sir 2 protein in liver tissues in ratmodelwith alcoholic fatty liver.M ethods：60male SD ratswere random ly divided into 6 groups with 10 rats in each group.50 rats were fed with high fat diet and ethanol fed to establish the experimentalmodel of alcoholic fatty liver.The animals of the experimental group were treated with different doses of Jiawei Linggui Zhugan Decoction and ethanol gavage.The total cholesterol（CHOL），triglyceride（TG）and fatty acid（FFA）in blood of animalsweremeasured with biochemical analyzer.The expressions of ADRP，PPAR-γand Sir2 mRNA and proteins in liver tissues were analyzed through RT-PCR and western blot.Results：Compared with themodel group，the levels of TG，CHOL and FFA in serum of ratmodels，treated with Jiawei Linggui Zhugan Decoction with medium-dosage and the high for 6 weeks，were significantly lower（P＜0.05）.Jiawei Linggui Zhugan Decoction could significantly decrease the expression of ADRP，PPAR-γ，and up-regulated the expression of Sir 2 in liver tissue.Conclusion：Jiawei Linggui Zhugan Decoction can change the expression of ADRP，PPAR-γand Sir 2 in liver tissue，thereby inhibiting the occurrence of fatty liver.

【Key words】Alcoholic fatty liver；Jiawei Linggui Zhugan Decoction；ADRP；PPAR-γ；Sir2

酒精性脂肪肝（AFL）是指由于长期酒精摄入过量而导致的肝脏疾病［1］。随着生活水平的提高，我国酒精性脂肪肝患者急剧增长［2］。AFL在早期是可以逆转的，经戒酒和治疗后，肝损害可逐渐得以改善［3］。如果不及时治疗，则演变为不可逆转肝纤维化［4］。因此，在积极戒酒之外寻找疗效可靠的药物就显得尤为重要［5］。脂肪肝在中医上归属于“胁痛”“肥气”“肝着”“痰浊”“积聚”的范畴。嗜酒食肥甘厚味，伤及脾胃；加之久卧久坐，体丰痰盛，或情志失常，长期忧思郁怒，感受湿热疫毒等，均可导致肝失疏泄，脾失健运，水湿停聚，痰浊郁结，气滞血瘀，最终形成湿痰瘀阻互结，痹阻肝脏脉络而成。加味苓桂术甘方临床用于治疗酒精性脂肪肝，效果良好［6］，但对其具体的分子机理尚未见报道。本研究以酒精性脂肪肝大鼠模型为研究对象，通过RT-PCR和Western blot技术检测给药前后动物肝脏组织中脂肪分化相关蛋白（ADRP）、过氧化物酶体增殖活化物受体γ（PPAR-γ）和沉默信息调控子2（Sir2）mR NA和蛋白的水平，从分子水平探讨加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝治疗作用的机理。

1　材料与方法

1.1实验动物SD雄性大鼠60只，购自西安交通大学医学院实验动物中心，体质量（200±20）g，合格证号：2015A023，实验室温度控制在20℃～25℃，相对湿度50%～70%，光暗周期为12 h。

1.2药物与试剂加味苓桂术甘方：山楂15 g，决明子10 g，茯苓12 g，泽泻20 g，术10 g，桂枝10 g，荷叶10 g，甘草8 g，丹参15 g，姜黄10 g，桃仁10 g，川芎10 g，葛花10 g。所有药材均购自陕西中医药大学第二附属医院中药房，并经陕西中医药大学中药教研室鉴定。所有药物称量好后，加注射用水400 mL，煎煮20 min后，取滤液浓缩至75mL（2 g/mL），4℃冰箱保存、备用。Trizol RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司、逆转录聚合酶链式反应试剂盒购自大连宝生物工程有限公司、二甲基亚硝胺及其他试剂购自Sigma-Aldrich（中国）公司、PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3分组与造模大鼠随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，加味苓桂术甘方小剂量组、加味苓桂术甘方中剂量组、加味苓桂术甘方大剂量组，阳性对照组，每组10只。实验室适应性喂养1周后，正常对照组动物饲喂正常饲料；另外50只实验开始第1～3天按15mL/（kg·d）给予含乙醇体积分数为15%的白酒灌胃；第4天起按15mL/（kg·d）给予含乙醇体积分数为52%的北京二锅头白酒灌胃。同时饲喂自制的富含脂肪的饲料（普通饲料与猪油比例为85∶15，硫酸亚铁含量15 g/kg饲料），自由饮水，连续6周。

1.4给药方法正常对照组动物饲喂普通饲料，自由进食。模型对照组大鼠给予每日1次生理盐水灌胃，每次4mL，自由进食。加味苓桂术甘颗粒小、中、大剂量组分别给予质量浓度为0.5、1、2 g/mL加味苓桂术甘汤灌胃，每次4mL，每日1次，自由进食。阳性对照组，按20 mL/kg体质量灌服美他多辛溶液，每日1次，自由进食。连续给药6周。

1.5标本采集与检测

1.5.1血脂含量检测给药结束后，动物禁食12 h，称体质量，取腹主动脉血液2mL，置于抗凝管内。静置2 h后，3000 r/min离心10min，取上清液得血清。按照血脂检测试剂盒的明书操作，利用生化分析仪检测血样中总胆固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、脂肪酸（FFA）的含量。

1.5.2RT-PCR检测肝脏组织ADRP、PPARγ和Sir2的mRNA水平给药结束后，处死动物，取0.3 g肝组织，用Trizol试剂提取细胞的总RNA，经逆转录反应得到cDNA。将逆转录得到的cDNA分别按1、10、100和1000的倍数稀释，然后按照TaKaRa反转录和PCR试剂盒的说明，在ABI 7300 Real-time PCR仪（Applied Biosystems）进行PCR反应。反应引物序列为：ADRP：5′-CTTGTGTCCTCCGCTTATGTCAGT-3′，5′-CTGCT CCTTTGGTCTTATCCACCA-3′；PPA-γ：5′-ATTCTGG CCCACCAACTTCGG-3′，5′-TGGAAGCCTGATGCTTTATCCCCA-3′；Sir2：5′-TGGCGGAGAGGCAGAGATG GAC-3′，5′-GGCGGATGAAGTAGTGGCAGATGG-3′；β-actin：5′-CAGTAA CAGTCCGCCTAGAA-3′，5′-GA TTACTGCTCTGGCTCCTA-3′。反应完后，计算各组样品中mRNA的平均Ct值，再进行归一化处理，得到ΔΔ-Ct，最后用相对定量法（RQ=2-ΔΔCt）计算给药前后各基因表达的差异。

1.5.3免疫印迹肝脏组织PPAR-γ、ADRP和Sir2蛋白表达所有动物连续给药6周后处死，摘取全部肝脏，取100mg肝脏组织，用蛋白提取试剂盒提取肝脏组织的总蛋白。然后取含有100μg总蛋白的细胞裂解产物进行SDS-PAGE电泳；电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，用含有5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭PVDF膜1 h后，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15min，二抗稀释液室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15min，ECL显影，暗室曝光。

1.6统计学处理应用SPSS 13.0软件包处理数据，计量资料以（表示，采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠血脂含量比较见表1。结果示，与正常组比较，造模6周后，模型对照组大鼠血清TG、CHOL和FFA水平均明显升高；与模型对照组相比，给药6周后加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组大鼠血清中TG、CHOL和FFA水平均有明显下降（P＜0.05）。2.2各组大鼠肝脏ADRP、PPAR-γ和Sir2mRNA水平比较见表2。与正常对照组比较，造模6周的模型大鼠ADRP、PPAR-γmRNA表达明显升高。给予中剂量和大剂量加味苓桂术甘方灌胃6周后，加味苓桂术甘方大中剂量组大鼠ADRP、PPAR-γmRNA表达显著下降，Sir2mRNA的表达水平显著上升。

表1　各组大鼠血清中TG、CHOL和FFA含量比较（mmol/L，

表1　各组大鼠血清中TG、CHOL和FFA含量比较（mmol/L，

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别n FFA正常对照组10 0.48±0.12**模型对照组10 1.38±0.47△△加味苓桂术甘方小剂量组10 1.23±0.47 TG CHOL 1.86±0.23*2.14±2.47*2.54±0.22△3.22±0.56△2.28±1.23 3.24±0.89加味苓桂术甘方中剂量组10 0.63±0.23*2.12±0.46*2.32±0.57*加味苓桂术甘方大剂量组10 1.94±0.76*2.21±0.76*0.52±0.25**阳性对照组10 1.88±0.49*2.18±0.48*0.51±0.24**

表2　各组大鼠肝脏ADRP、PPAR-γ和Sir2mRNA水平比较（

表2　各组大鼠肝脏ADRP、PPAR-γ和Sir2mRNA水平比较（

组别n Sir2/β-actin正常对照组10 0.71±0.26**模型对照组10 0.38±0.19△加味苓桂术甘方小剂量组10 0.46±0.17 ADRP/β-actin PPAR-γ/β-actin 0.21±0.16*0.26±0.12*0.48±0.21△0.68±0.23△0.42±0.17 0.52±0.17加味苓桂术甘方中剂量组10 0.55±0.29*0.29±0.19*0.35±0.09*加味苓桂术甘方大剂量组10 0.23±0.28*0.32±0.17*0.62±0.27**阳性对照组10 0.22±0.11*0.29±0.11*0.69±0.21**

2.3各组大鼠肝脏ADRP、PPAR-γ和Sir2蛋白表达的影响见图1。Western blot分析显示，与正常对照组大鼠相比，造模6周后的AFL大鼠肝脏组织中ADRP和PPAR-γ蛋白表达水平明显升高。模型组动物给予中剂量加味苓桂术甘方灌胃6周后，ADRP和PPAR-γ的蛋白表达有明显下降，Sir2蛋白表达相对含量明显高升高。

图1　各组大鼠肝脏ADRP、PPAR-γ和Sir2蛋白表达

3　讨　论

随着我国人们生活水平的提高和饮食结构的改变，酒精消耗量也在逐年增加，AFL的发病率在我国亦逐年增高，女性每日酒精饮用量超过10～20 g，男性超过20～40 g即可形成［5］。AFL的发病机制可能与乙醇及其代谢产物对肝脏的损伤以及氧化应激、脂质过氧化、脂质代谢紊乱和脂肪细胞因子等因素有关［6-7］。脂肪分化相关蛋白（ADRP）是一种存在于灵长类脂肪细胞的相对分子量为48 KD的蛋白质，是脂肪细胞早期分化及脂质积聚的标志［8-9］。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是一类由配体活化的核转录因子。PPARs是调节脂质代谢、脂肪生成、胰岛素敏感、炎性反应以及细胞生长和分化的重要因子［10］，长链脂肪酸可引起PPARγ信号传导的异常，促进ADRP的表达［11-12］。其中，PPAR-γ可刺激前脂肪细胞分化为脂肪细胞，PPAR-γ的高表达可诱导肝细胞脂肪酸重新合成，引起脂质蓄积［13］。沉默信息调控子2（Sir2）是一种高度保守，具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性的组蛋白去乙酰基转移酶［14］。Sir2通过抑制PPAR-γ活性，从而调控甘油三酯在细胞中的积累，下调脂肪储存相关基因的转录［15］。Sir2蛋白过度表达可减少脂肪形成，降低体内脂质过氧化积累，对Sir2进行RNA干涉可以增加脂肪形成［16-17］。研究表明，在非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠体内，Sir2表达明显降低［18］。

加味苓桂术甘方是临床上治疗AFL的方剂，方中茯苓、泽泻、苍术健脾渗湿为君药；桂枝通阳化气，桃仁、红花和姜黄活血行气化瘀，川芎、赤芍养血柔肝，缓急止痛，使肝气条达，血脉通畅，为臣药；山楂消食化积、散瘀行滞，决明子清肝明目，润肠通便，为佐药；葛花解酒醒脾。甘草调和诸药为使药。全方共奏化痰解毒，逐瘀化积之功。研究表明，加味苓桂术甘汤对代谢综合征模型大鼠的血浆TC、TG升高有一定调节作用，并使之趋于正常［19］。

本研究结果显示，酒精性脂肪肝大鼠灌胃加味苓桂术甘方6周后，ADRP、PPARγ的mRNA表达下降，而Sir2mRNA的表达升高。Western blot分析显示，与模型对照组大鼠相比，加味苓桂术甘方给药6周后AFL模型大鼠ADRP和PPARγ蛋白表达水平明显下降，Sir2蛋白表达水平明显升高。综上所述，加味苓桂术甘方对AFL大鼠有一定防治作用，其可能的作用机制是加味苓桂术甘方通过上调Sir2，从而进一步抑制ADRP和PPAR-γ的表达，改善脂质代谢紊乱作用，调节炎症因子以及抗脂质过氧化作用，从而抑制肝脏中脂肪的堆积。但有关加味苓桂术甘方对AFL脂质代谢影响的作用机制还有待于进一步研究。

［l］Susman S，Dent CW，Skara S，el al．Alcoholic liver disease（ALD）：a new domain for prevention effort［J］．Subst Use Misuse，2002，37（14）：1887-1904．

［2］Neusehwander-TetriBA.Caldwell SI-LNonalcoholic steatohepatitis：summary of an AASLD single topic conference［J］. Hepatology，2003，37（5）：1202-1219．

［3］中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南［J］.肝脏，2010，2（4）：49-53．

［4］牛术仙，仲云，李勇.肝脂清治疗酒精性脂肪肝大鼠的实验研究［J］.中西医结合肝病杂志，2011，21（2）：97.

［5］AminiM，Runyon BA.Alcoholic hepatitis 2010：a clinician's guide to diagnosis and therapy［J］.World JGastroenterol，2010，16：4905-4912.

［6］Schaffert CS，Duryee MJ，Hunter CD，et al.Alcoholmetabo-litesand lipopolysaccharide：roles in the developmentand/or progression of alcoholic liver disease［J］.World JGastroenterol，2009，15（20）：1209-1218.

［7］Xiong S，She H，Zhang AS，et al.Hepatic macrophage iron aggravates experimental alcoholic steatohepatitis［J］.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol，2008，29（5）：512-521.

［8］黄蜂.加味苓桂术甘颗粒治疗酒精性脂肪肝痰瘀互结证30例［J］.陕西中医，2012，33（2）：180-182.

［9］徐斌，赵慧颖.脂肪分化相关蛋白在动脉粥样硬化脂质蓄积中的作用［J］.牡丹江医学院学报，2009，30（6）：60-63.

［10］Tsochatzis EA，Papatheodoridis GV，Archimandritis AJ. Adipokines in nonalcoholic steatohepatitis：from pathogenesis to implications in diagnosis and therapy［J］.Mediators Inflamm，2009，3：1-8.

［11］Byun JS，JeongWI.Involvementofhepatic innate immunity in alcoholic liverdisease［J］.Immune Netw，2010，10：181-187.

［12］Hines IN，Wheeler MD.Recent advances in alcoholic liver disease III.Role of the innate immune response in alcoholic hepatitis［J］.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2004，287（2）：310-314.

［13］Moya M，Gomez-Lechon MJ，Castell JV，et al.Enhanced steatosis by nuclear receptor ligands：a study in cultured human hepatocytes and hepatoma cells with a characterized nuclear receptor expression profile［J］.Chem Biol Interact，2010，184（3）：376-387.

［14］Steppan CM，Bailey ST，Bhat S，et al.The hormone resistin linksobesity to diabetes［J］.Nature，2001，409：307-312.

［15］Lebensztejn DM，Wojtkowska M，Skiba E，et al.Serum concentration ofadiponectin，leptin and resistin in obese children with non-alcoholic fatty liver disease［J］.Adv Med Sci，2009，54：177-182.

［16］Donohue TM，Jr.Alcohol-induced steatosis in liver cells［J］. World JGastroenterol，2007，13（3）：4974-4978.

［17］Albano E，Vidali M.Immune mechanisms in alcoholic liver disease［J］.GenesNutr，2010，5（2）：141-147.

［18］Qin Y，Tian YP.Preventive effects of chronic ex ogenous growth hormone levels on diet-induced hepatic steatosis in rats［J］.Lipids Health Dis，2010，9：78.

［19］杜亚明，黄江荣，李祥华，等.味苓桂术甘汤对代谢综合征大鼠体质量、血压和脂代谢的影响［J］.中药药理与临床，2013，29（1）：111-113.

E ffects of Jiawei Linggui Zhugan Decoction on Expression of ADRP，PPAR-γand Sir 2 Protein in Liver Tissues in Rat M odelw ith A lcoholic Fatty Liver

CHAO Xu，WANG Yueyue，DU Jing，et al.The College of Preclinical Sciences，ShaanxiUniversity of Chinese Medicine，Shaanxi，Xianyang 712046，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1663-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.006

2016-04-16）

陕西省咸阳市科技计划项目（2014K04-02）