三氧化二砷对胶原诱导血小板聚集的抑制作用机制研究△

刘志萍　郭俊峰　陈洁　张大昕

哈尔滨医科大学附属第一医院肿瘤科，哈尔滨150001

三氧化二砷对胶原诱导血小板聚集的抑制作用机制研究△

刘志萍#郭俊峰陈洁张大昕

哈尔滨医科大学附属第一医院肿瘤科，哈尔滨150001

目的分析三氧化二砷是否影响胶原诱导的血小板聚集及其作用机制。方法使用胶原诱导血小板聚集。采用光比浊法检测三氧化二砷对胶原诱导的抑制作用，使用流式细胞仪检测血小板聚集过程中表面膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（glycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）变化，使用免疫分析试剂盒检测血小板聚集过程中释放血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）的浓度。结果胶原诱导的血小板聚集过程中，三氧化二砷明显抑制血小板血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的释放。三氧化二砷并未影响血小板聚集过程中血小板表面GPⅡb/Ⅲa变化。结论三氧化二砷通过阻断血小板TXA2激活路径抑制胶原诱导的血小板聚集。

血小板聚集；三氧化二砷；糖蛋白Ⅱb/Ⅲa；血栓素A2

血小板除止血作用外，其促肿瘤细胞转移作用逐渐被重视。至今已证实阿司匹林衍生物、水蛭素、肝素等抗凝剂，可通过抑制血小板聚集来抑制肿瘤细胞转移［1-2］，但是这些药物的出血倾向限制其长期应用。因此，一种既可以抑制血小板活性，又无出血不良反应的药物亟待问世。采用三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病可有效避免患者凝血紊乱，并且三氧化二砷抑制血小板聚集作用已经引起关注［3］，但其抗血小板聚集作用的机制尚不明确，现体外试验观察三氧化二砷对人血小板聚集的抑制作用及其作用机制，报道如下。

1　材料与方法

1.1主要材料与仪器

阿司匹林、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa单克隆抗体7E3购于美国Sigma公司。三氧化二砷购于哈尔滨伊达药业有限公司。标记GPⅡb/Ⅲa荧光试剂（PAC1-FITC）购于美国BD公司。ELISA法TXB2检测试剂盒购于英国Pharmacia公司。光学血小板聚集分析仪（ChronoLog-560CA）购于美国VASTEC公司。双激光五色流式细胞仪（FC500）购于美国Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1制备清洗血小板健康志愿者采集静脉血10 ml加入枸橼酸钠1∶9抗凝管中，于30 min内离心10～15 min（1000 rpm/min），取上层富含血小板血浆，再次离心10 min（2500 r/min），使用CGS缓冲液（0.12 mol/L NaCl+12.9 mmol/L柠檬酸三钠+ 30 mmol/L葡萄糖，pH 6.5）清洗沉淀血小板两次，将血小板悬浮于新鲜的台氏缓冲液，调整血小板浓度为300×106/ml，37℃静置1 h备用。

1.2.2血小板聚集试验比浊杯中加入200 μl血小板（300×106/ml）及50 μl胶原蛋白（1 μmol/L），磁棒搅拌，光学血小板聚集分析仪监测血小板聚集15 min，记录血小板最大聚集率。

1.2.3GPⅡb/Ⅲa检测当血小板聚集达到50%最大透光度，使用10倍生理盐水终止聚集反应。将样品与PAC1-FITC（10 μg/ml）室温下避光孵育5 min，使用流式细胞仪分析记录血小板表面GPⅡb/Ⅲa荧光强度。

1.2.4血栓素A2检测血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）释放后很快转化成TXB2，检测TXB2用以代表TXA2浓度。当血小板聚集达到50%最大透光度，使用10倍生理盐水终止聚集反应。离心后留上清液供ELISA法检测TXB2浓度。

1.3统计学方法

每个实验至少重复3次。实验结果表达使用平均数±标准差（x-±s）。采用SPSS 21.0软件进行研究分析，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同浓度三氧化二砷抑制血小板聚集

将不同浓度三氧化二砷（0、1、5、10、20、30 μmol/L）50 μl与200 μl血小板（200×106/ml）37℃孵育3 min，加入50 μl胶原蛋白（1 μmol/L）。以上浓度血小板最大聚集率分别为：（45±3.5）%、（37±2.1）%、（31±2.3）%、（27±1.9）%、（26±1.5）%、（23±1.6）%。三氧化二砷0、1、5、10 μmol/L对胶原诱导的血小板聚集抑制呈浓度依赖，4种浓度聚集率比较，差异具有统计学意义（P＜0.001）；20 μmol/L和30 μmol/L三氧化二砷对血小板聚集抑制与10 μmol/L相比差异无统计学意义（P=0.542，P=0.068）。选择三氧化二砷10 μmol/L作为下一步实验浓度。（图1）

图1　不同浓度三氧化二砷对胶原诱导血小板聚集的抑制作用

2.2不同抑制剂作用于胶原诱导的血小板聚集

胶原组：胶原蛋白（1 μmol/L）诱导血小板聚集；7E3组、阿司匹林组、三氧化二砷组：将抗体7E3（20 μg/ml）、阿司匹林（50 μg/ml）、三氧化二砷（10 μmol/L）各50 μl分别与200 μl血小板（300×106/ ml）孵育3 min，加入50 μl胶原（1 μmol/L）诱导血小板聚集。各组最大聚集率分别为（图2）：胶原组（45±3.5）%、7E3组（30±2.6）%、阿司匹林组（23± 2.4）%、三氧化二砷组（27±1.9）%。7E3与阿司匹林均为血小板抑制剂，为阳性对照。三氧化二砷组与胶原组最大聚集率比较，三氧化二砷明显抑制胶原诱导的血小板聚集，P＜0.001。

图2　不同抑制剂对胶原诱导血小板聚集的抑制

2.3血小板表面GPⅡb/Ⅲa变化

对照组：未经胶原处理的血小板作为阴性对照。胶原组：胶原蛋白（1 μmol/L）诱导血小板聚集。7E3组、三氧化二砷组：将7E3（20 μg/ml）、三氧化二砷（10 μmol/L）各50 μl分别与血小板（300× 106/ml）孵育3 min，加入胶原诱导血小板聚集。以上各组检测GPⅡb/Ⅲa荧光强度，记录各组与对照组比值。如图3所示，胶原组、7E3组、三氧化二砷组荧光强度分别为（405±13）%、（273±11）%、（392± 11）%。7E3为血小板GPⅡb/Ⅲa抗体，此组为阳性对照。三氧化二砷组与胶原组比较，GPⅡb/Ⅲa荧光强度无差别（P=0.229）。

图3　不同处理组对胶原诱导血小板表面GPⅡb/Ⅲa的影响

2.4血小板释放TXA2

对照组：未经胶原处理的血小板作为阴性对照。胶原组：胶原蛋白（1 μmol/L）诱导血小板聚集。阿司匹林组、三氧化二砷组：将阿司匹林（50 μg/ml）、三氧化二砷（10 μmol/L）分别与血小板（300×106/ml）孵育3 min，加入胶原诱导血小板聚集。以上各组检测TXB2，记录各组与对照组比值。如图4所示，胶原组、阿司匹林组、三氧化二砷组TXB2浓度分别为（137±10）%、（89±9.6）%、（114±7.2）%。阿司匹林为血小板释放TXA2抑制剂，此组为阳性对照。三氧化二砷组与胶原组比较，TXB2释放明显减少，差异具有统计学意义（P=0.019）。

3　讨论

血小板在肿瘤细胞血行转移中发挥重要作用。体外实验已经证实血小板具有以下功能［4］：包被在肿瘤细胞外以保护肿瘤细胞；能够辅助肿瘤细胞穿出血管到达转移位置；分泌生长因子促进肿瘤细胞生长、侵袭；有助于肿瘤转移灶形成。临床试验已经证实，肿瘤患者血液中血小板数量增高，直接影响预后。非小细胞肺癌术前血小板数量＞300×106/ml［5］；结直肠癌肝转移患者血小板数＞380×106/ml［6］，为无病生存及总生存不良预后因素。

图4　不同处理组对胶原诱导血小板释放TXA2的影响

血小板具有完整的胞膜，被激活后表达各种膜受体。整合素为血小板表面受体的一个大家族，其中糖蛋白Ⅱb/Ⅲa介导细胞与细胞的黏附，在肿瘤细胞与血小板膜相互作用中发挥重要作用。Zhang等［1］研究发现，血小板表面GPⅡb/Ⅲa参与恶性黑色素瘤细胞与血小板相互作用，肝素衍生物抑制恶性黑色素瘤细胞与血小板表面GPⅡb/Ⅲa联结，并且肝素衍生物抑制恶性黑色素瘤细胞与血小板在肺血管内相互黏附，抑制转移灶形成。Lonsdorf等［7］使用肺转移鼠模型发现，利用抗体阻滞血小板表面GPⅡb/Ⅲa，使恶性黑色素瘤细胞系B16肺转移减少。

TXA2存在于血小板内，激活后释放于细胞外，作用于血小板表面血栓素前列腺素（thromboxane prostanoid，TP）受体，促进血小板聚集。TXA2前体为花生四烯酸（arachidonic acid，AA），中间经环氧化酶（cyclooxygenase，COX）作用生成TXA2，阿司匹林通过抑制COX减少TXA2生成。阿司匹林抑制TXA2生成具有剂量依赖性，口服100 mg阿司匹林能够完全抑制TXA2生成［8］。因此，口服小剂量阿司匹林不仅能预防动脉粥样硬化、预防静脉血栓，还能够预防结肠癌［9］。但长期服用阿司匹林有胃肠道出血倾向。

三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）已经取得较好的疗效，并且在治疗APL过程中，能够有力控制APL伴随的凝血异常。Lin等［3］发现三氧化二砷能抑制胶原诱导的血小板聚集，其机制为抑制PLCg2-PKC-p38 MAPK级联反应，引起钙离子与自由基形成减少。Hoffman等［10］经体外细胞培养结果显示，三氧化二砷抑制MCF-7与WM-115细胞系的促凝活性。本研究体外实验结果表明，三氧化二砷抑制血小板聚集，明显抑制血小板TXA2释放，但未影响血小板表面受体GPⅡb/Ⅲa表达，可见三氧化二砷除抑制MAPK级联反应外，尚能够通过抑制TXA2释放来抑制血小板聚集。TXA2释放被抑制的过程包括：TXA2由花生四烯酸衍变生成，TXA2分泌于血小板外。关于三氧化二砷作用于此过程的具体环节尚不确定，有待于进一步实验证实。

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The inhibitory mechanism of arsenic trioxide on collagen-induced platelet aggregation△

LIU Zhi-ping#GUO Jun-feng CHEN Jie ZHANG Da-xin
Department of Oncology，the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

ObjectiveTo analyze whether arsenic trioxide has an effect on collagen-induced platelet aggregation and its potential mechanisms.Method Collagen was used to induce platelet aggregation.The inhibitory effects of arsenic trioxide on platelet aggregation were measured by light transmission aggregometry.The abundance of glycoprotein IIb/IIIa（GP IIb/IIIa）on the surface of the platelets during aggregation was measured by flow cytometry.The concentration of（thromboxane B2，TXB2）was measured by an enzyme immunoassay kit.ResultArsenic trioxide inhibited（thromboxane A2，TXA2）release from platelet during collagen-induced platelet aggregation.Arsenic trioxide did not affect GPIIb/ IIIa on the surface of the platelets in the course of platelet aggregation.ConclusionArsenic trioxide inhibits collagen-induced platelet aggregation through blocking TXA2 activation pathway.

platelet aggregation；arsenic trioxide；glycoprotein IIb/IIIa；thromboxane A2 Oncol Prog，2016，14（2）

R730.53

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.02.19

2015-08-10）

黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助（12521340）#

（corresponding author），邮箱：as150001@aliyun.com