响应面法优化红花酢浆草抑菌活性物质的提取工艺研究

张玉枫，张金华，黄　瑶，李开秀，杨莉娜，王　丹

（1.成都医学院生物医学系，四川 成都 610500；2.中国科学院环境与应用微生物重点实验室，四川 成都 610041）

响应面法优化红花酢浆草抑菌活性物质的提取工艺研究

张玉枫1，张金华1，黄瑶1，李开秀1，杨莉娜2，王丹1

（1.成都医学院生物医学系，四川 成都 610500；2.中国科学院环境与应用微生物重点实验室，四川 成都 610041）

为建立红花酢浆草抑菌活性物质的最佳提取工艺，在单因素实验的基础上，选取提取时间、乙醇体积分数和固液比为自变量，抑菌圈直径为响应值，建立数学模型，求解得到最佳提取条件和理论最大抑菌圈并验证。结果显示，红花酢浆草抑菌活性物质的最佳提取工艺为：乙醇体积分数73%，提取时间78min，固液比1∶31g/mL。此时，红花酢浆草醇提取物拮抗金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为30.17mm，较优化前提高67.61%。响应面优化法不仅效率高，而且可靠性强，可准确预测抑菌圈直径。同时，证明红花酢浆草的醇提取物具有较为广泛的抑菌谱。

红花酢浆草；抑菌活性；响应面法；抑菌谱；提取工艺

0　引　言

目前，抗生素滥用引起的致病菌株耐药问题日趋严重[1-2]。研究发现，中草药抗菌谱广、副作用小、耐药性低，同时兼具来源广泛、价格低廉等优点[3-4]；因此，筛选抗菌中草药、探究其作用机制逐渐成为研究热点[5-6]。红花酢浆草（Oxalis corymbosa）又名三叶草、大酸味草等，原产巴西和南非好望角，在我国分布广泛[7]。作为一种传统中药，红花酢浆草常用于治疗咽峡炎、扁桃体炎、腮腺炎等疾病[8]。目前，已证实酢浆草中富含多种生物活性物质，如β-谷甾醇、β-生育酚、胡萝卜苷、酒石酸等[9-10]。其中，黄酮类、总酚类物质具有较强的抗菌及抗氧化等生物活性[11-12]。本课题组在前期研究中，分别以细菌、真菌作为指示菌，利用杯碟法检测黄葛兰紫荆、马蓼、千里香等20种植物的抑菌活性，其中红花酢浆草乙醇提取物的抑菌活性最佳，且抑菌谱广泛。此外，和正交试验相比，响应曲面法采用多元二次回归方法，通过研究因素与因素间的交互作用，对拟合后的回归方程进行分析，筛选最佳提取条件，同时能直观地分析各因素的相互影响，试验周期短，结果更加直观、可靠[13-14]。因此，本文利用响应面法优化红花酢浆草抑菌活性物质的提取工艺。

1　材料与仪器

1.1药品与试剂

红花酢浆草，采自成都植物园及成都医学院校园；乙醇、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏、琼脂等均为分析纯，购自成都科龙公司。

1.2菌种与培养基

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏杆菌（Salmonella enteritidis）等细菌；白色念珠菌（Monilia albican）、八孢裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus）、汉逊酵母（Hansenula polymorpha）、假丝酵母（Candida albicans）、隐球酵母（Cryptococcus neoformans）、土曲霉（Aspergillus terreus）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、放射毛霉（Actinomucor elegans）、绿色木霉（Trichoderma viride）等真菌保存于成都医学院生物技术实验中心。

指示细菌培养基为NA培养基；指示真菌培养基为PDA培养基。

1.3仪器

旋转蒸发仪（SWITZERLAND公司）；SHB-IIIG真空泵：（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；ZHWY-100H恒温培养振荡器（海智城分析仪器制造有限公司）；SW-GJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）。

2　方　法

2.1抑菌活性物质的制备

采集新鲜红花酢浆草叶和茎，洗净，50℃烘箱内烘干。经打粉机粉碎为≤100目的粉末，4℃避光保存。采用冷浸法提取红花酢浆草的抑菌活性物质[15]：称取粉末4 g，装入250 mL三角瓶，按照1∶50 g/mL加入50%的乙醇200mL，室温静置2d。布氏漏斗真空抽滤，收集滤液，将滤液转移到蒸馏烧瓶中蒸馏浓缩。蒸馏温度为50℃，浓缩到10mL，45 μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃冰箱避光保存。

2.2抑菌活性检测

采用管碟法检测提取液的体外抑菌活性。指示菌选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌沙门氏杆菌，将OD600在2.2～2.4的菌液稀释100倍，每个LB平板加130μL稀释菌液，涂布均匀。每个平板放3个牛津杯，每个平板设置3个平行组，每个牛津杯中加入提取液200 μL，4℃冰箱放置4 h后，37℃过夜培养，最后检测抑菌圈直径。

2.3单因素实验

以抑菌直径为考核指标，对乙醇浓度、提取时间、提取温度、固液比和提取次数5个提取条件进行优化，各个变量的取值范围见表1。

表1　5个提取条件的取值范围

2.4响应面法确定最佳提取工艺

通过单因素实验，选取提取时间、乙醇体积分数和固液比这3个主要的提取条件，提取温度设定为50℃，提取次数设定为1次。以提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为响应值，进行响应面法的Box-Behnken优化设计。以提取温度、乙醇体积分数和固液比为变量，通过Design Expect8.0.6进行试验设计，结果见表2。

3　结　果

3.1抑菌谱测定

由表3可见，红花酢浆草乙醇提取物不仅抑制巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌等11种细菌，还可以抑制白色念珠菌、土曲霉、绿色木霉等10种真菌的生长，具有较广的抑菌谱。

表2　响应面分析实验因素水平表

3.2单因素实验

3.2.1提取时间对抑菌效果的影响

分别以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌沙门氏杆菌为指示菌，考察提取时间对乙醇提取物抑菌活性的影响。由图1可知，随着时间的增加，乙醇提取物的抑菌圈直径逐渐增大；当提取时间超过70min后，抑菌圈直径开始减小。究其原因，可能是提取时间过长，导致有效物质的分解失活，最终确定最佳提取时间为70min。

图1　提取时间对抑菌圈直径的影响

3.2.2提取温度对抑菌效果的影响

由图2可见，随着提取温度的增加，乙醇提取物的抑菌圈直径逐渐增大。当超过50℃后，继续升高温度，抑菌圈直径开始降低。这可能是因为温度过高导致有效物质失活，因此确定最佳提取温度为50℃。

图2　提取温度对抑菌圈直径的影响

3.2.3乙醇体积分数对抑菌效果的影响

研究发现，随着乙醇体积分数的增加，红花酢浆草乙醇提取物的抑菌圈直径逐渐增大，当乙醇体积分数达到70%时，达到最大值。而乙醇提取分数为90%时，提取物抑菌活性下降。这可能是因为乙醇体积分数过大时水溶性的有效物质溶解减少，其他没有活性的脂溶性物质溶解增加，故确定最佳乙醇体积分数为70%。

图3　乙醇体积分数对抑菌圈直径的影响

3.2.4固液比对抑菌效果的影响

从图4中可见，对于金黄色葡萄球菌而言，固液比从1∶5增加到1∶15后抑菌圈直径增大，但继续增大固液比后，抑菌圈直径变化不大。T检验可以看出不同固液比之间没有显著性差异。而以沙门氏杆菌作为指示菌时，随着固液比从1∶5增加到1∶35的过程中，抑菌圈直径逐渐增大，但继续增大固液比后，抑菌圈直径开始降低。T检验可以看出1∶35下的固液比与1∶5、1∶25和1∶45下的抑菌圈直径之间的P＜0.05，有显著性差异，存在统计学意义，于是最佳固液比值确定为1∶35。

图4　固液比对抑菌圈直径的影响

3.2.5提取次数对抑菌效果的影响

从图5中可以看出，对于金黄色葡萄球菌而言，随着提取次数从1次变为2次后，抑菌圈直径显著增大，而3次时抑菌圈直径略微减小，但差异不显著。当以沙门氏杆菌作为指示菌时，从图中可以看出随着提取次数的增加抑菌圈直径逐渐增大。但从减少生产能耗的角度，提取次数确定为1次。

3.3响应面法确定最佳提取工艺

3.3.1Box-Behnken试验设计及结果

根据单因素试验结果，确定影响红花酢浆草乙醇提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的主要因素为提取时间、乙醇体积分数和固液比。按表2的因素与水平设计一个3因素3水平的优化试验方案，其中中心点为5个，总共17组试验。

图5　提取次数对抑菌圈直径的影响

3.3.2建立数学模型

利用Design-Expert.8.0.6软件对表4中实验数据进行多元回归拟合，可得到提取时间、乙醇体积分数和固液比与抑菌直径的二次多元回归方程：

3.3.3方差分析

对表3中的实验结果进行统计学分析，得到的方差分析结果如表4所示。F检验（P=0.0009）证明回归方程在统计学上是显著的，相关系数r2=0.9520，说明响应面95.20%的变化可以用该模型来解释。只有0.08%的改变不能通过该模型拟合得到，可能是噪点的干扰。回归方程系数显著性结果见表5。X3（P=0.044 8）、X1和X2的交互作用（P=0.020 6）、X1的二次项（P=0.003 6）、X2的二次项（P<0.001)、X3的二次项（P=0.0119）对抑菌圈的直径影响显著。X1、X2、X1和X3的交互作用、X2和X3的交互作用对抑菌圈直径没有显著性影响。

表3　Box-Behnken试验设计及结果

表4　响应面二次模型方差分析表

表5　回归方程系数显著性结果

3.3.4响应曲面分析

应用Design-Expert.8.0.6软件绘制响应曲面图，可直观反映各因素对响应值影响的变化趋势，图示表明在所选因素水平范围内，均有最大响应值出现。如图6所示，在本试验水平范围内，当固液比处于中心水平（C=0）时，提取时间和乙醇体积分数交互影响红花酢浆草抑菌物质提取的曲面图和等高线图，由等高线的形状可以看出两因素的交互作用显著（椭圆形代表两因素交互作用显著）。

如图7所示，在本试验水平范围内，当乙醇体积分数处于中心水平（B=0）时，提取时间和固液比不同水平上的变化，引起响应值的变化不显著，所以提取时间和固液比的交互作用不明显。

如图8所示，在本试验水平范围内，当提取时间处于中心水平（A=0）时，随着固液比和乙醇体积分数的改变，响应值抑菌圈直径变化不大，所以说乙醇体积分数和固液比的交互作用不明显。

图6　提取时间和乙醇体积分数交互作用等高线图

图7　提取时间和固液比交互作用等高线图

图8　乙醇体积分数和固液比交互作用等高线图

3.3.5最大抑菌直径和最佳提取条件的确定

应用Design-Expert8.0.6软件预测的理想结果为：提取时间为77.81 min，固液比为1∶31.37，乙醇体积分数为72.52%；此时，获得的抑菌圈直径可达30.21mm，如图9所示。为了便于试验，提取时间定为78 min，固液比采用1∶31 g/mL，乙醇体积分数定为73%（见表6）。用以上最佳提取条件重复实验3次，抑菌圈直径为30.25，30.16，30.11mm，平均值为30.17mm，与预测值有很好的拟合性，证明了模型的可行性。

表6　模型最佳条件的验证

4　结束语

通过单因素实验和响应面法Box-Behnken分析建立了红花酢浆草抑菌活性物质的最佳提取工艺：提取时间78 min，固液比1∶31 g/mL，乙醇体积分数73%，此时获得的抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大值为30.17mm，较优化之前提高了67.61%（优化前后的抑菌圈直径对比如图10所示）。由此可见，本文利用响应面法建立数学模型可靠性强，能准确预测抑菌圈的直径，这为下一步的抑菌活性物质的分离、纯化，抑菌作用机制研究提供理论依据。

图9　响应面模拟最大抑菌圈直径

图10　优化前后的抑菌圈直径

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（编辑：莫婕）

Extraction process optimization of antibacterial active substance from Oxalis corymbosa by response surface method

ZHANG Yufeng1，ZHANG Jinhua1，HUANG Yao1，LI Kaixiu1，Yang Li’na2，WANG Dan1
（1.Department of Biomedicine，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China）

An optimum process is designed for extracting antibacterial active substance from Oxalis corymbosa.The extraction time，ethanolconcentration and solid-liquid ratioareselectedas independent variables based on single factor experiment and the diameter of the inhibition zone is considered as response value.After that，a mathematical model is established to calculate and verify the optimal extraction conditions and the theoretically maximum inhibition zone.The optimum extraction process is shown as follows：73%ethanol concentration，78min extraction time，1∶31g/mL solid-liquid ratio.Under these conditions，the maximum antibacterial diameter is 30.17 mm，which hasbeenincreasedby67.61%afteroptimization.Theresponsesurfaceoptimizationmethod introduced in this paper is not only efficient but also reliable；with it，the inhibition zone diameter has been accurately predicted.Besides，the alcohol extract of Oxalis corymbosa has been proved to have a wide range of antibacterial spectra.

Oxalis corymbosa；antimicrobial activity；response surface method；antibacterial spectrum；extraction process

A

1674-5124（2016）03-0053-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.03.013

2015-10-18；

2015-11-23

四川省教育厅重点项目（16ZA087）；国家级大学生创新训练项目（201513705006）；中国科学院环境与应用微生物重点实验室开放基金项目（KLCAS-2014-04）

张玉枫（1993-），男，四川宜宾市人，专业方向为生物技术。

王丹（1977-），女，辽宁辽阳市人，副教授，博士，主要从事生物制药相关方向的研究。