阿尔茨海默病线粒体铁蛋白的表达情况研究

湖南中医药高等专科学校（412012）刘起胜

湖南中医药大学（410007）成绍武 廖君 黄娟 葛金文

目前，已有研究显示线粒体铁蛋白（MtFt）与众多神经变性疾病有密切关系[1]，如不凝腿综合征、帕金森症以及遗传性家族共济失调等。本研究特进行相关大鼠实验后报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物 60只雄性大鼠由湖南医科大学动物实验中心提供，重量200～220g，许可证号SCXK（湘）2008-2002。

1.2 模型制备 模型组大鼠注射0.35g/kg剂量10%水合氯醛麻醉，后固定于I-C型脑立体定位仪上，常规消毒后切开皮肤，充分暴露前囟，参考大鼠脑立体定位图谱确定海马CA2区具体位置，后沿着垂直方向两侧埋植套管针，深度约24mm。1周后微量注射针对模型组大鼠两侧各推注Aβ寡聚体5ul，1次/d，连续3d。所有大鼠均为清洁级饲养。

1.3 方法

1.3.1 样本制备 切取大鼠海马CA2区，①样本于PBST液中清洗3遍，清洗时间5min/次。②将0.5%双氧水、PBST液混合，后置入样本浸泡约30min；取出样本重复①。③将PBST液、MtFt单克隆抗体混合，将后者稀释10倍；置入样本于4℃孵育16h。样本取出重复①。④用PBST液将生物素化后的IgG抗体稀释1000倍，后置入样本室温孵育1h，取出切片样本重复①。⑤应用PBST液将ABC试剂3000倍稀释，后置入样本常温孵育1h，取出切片样本重复①。⑥取500ul0.01g/ml的DAB液、3.75ul30%的双氧水、1ml7%的镍离子液以及25mlTris-HCl液制成混合液，后置入样本，待其变色后加入Tris-HCl溶液以终止反应。⑦取出样本置于载玻片后置干燥板上干燥。⑧将干燥好的样本用乙醇液脱水，后将样本放入二甲苯内浸泡5min，后盖上盖玻片。

1.3.2 real-time PCR 首先分别提取样本中RNA，制备cRNA。real-time PCR反应流程为：25℃10min，48℃30min，95℃5min，25℃10min。整个反应连续进行25个循环。

1.4 数据处理 SPSS18.0软件进行统计，计量资料“±s”表示，用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本染色结果 经切片观察显示，AD大鼠海马CA2区MtFt数量及密度均显著高于正常大鼠。

2.2 real-time PCR法检测情况（见附图）。IMR-32分别加入转染试剂、转染空质粒、MtFt质粒，转染有MtFt的IMR-32细胞中mRNA表达量显著降低，P＜0.01差异显著。

附图 real-time PCR法检测情况

3 讨论

铁作为生命体不可或缺的一种金属元素，具有维持细胞正常功能的作用，参与了脑组织中重要代谢过程。线粒体是细胞电子传递以及能量代谢最为旺盛的细胞器，而细胞所摄取的大部分铁都需进入到线粒体内参与相关代谢过程。

相关研究显示，MtFt的结构、功能与胞浆中铁蛋白有高度同源性，且其可能具有调节线粒体稳态，保护线粒体免受应激损伤，对血红素、铁硫基团合成等方面的调节作用。本研究通过建立AD大鼠模型发现，MtFt在脑组织神经元内广泛存在，但通过对AD模型大鼠海马CA2区我们发现，模型组MtFt数量及密度均显著高于对照组大鼠。说明MtFt在AD所致的病理状态变化下表达量明显增加。同时，本研究还显示转染有MtFt的IMR-32细胞中mRNA表达量显著降低。说明MtFt能够改善Aβ所致的炎症反应，对细胞具有一定保护作用。这提示MtFt对AD病变时炎性反应损伤有保护作用，有助于抵抗细胞早期凋亡。

综上，AD病变发生后MtFt表达量显著升高，而MtFt对AD所致炎症反应具有一定保护作用。