电子鼻结合气相色谱-质谱联用技术分析冷藏期间刺参挥发性成分的变化

张鹏，肖水水，李江阔*，农绍庄

1(国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津，300384)2(大连工业大学 食品学院，辽宁 大连，116034)



电子鼻结合气相色谱-质谱联用技术分析冷藏期间刺参挥发性成分的变化

张鹏1，肖水水2，李江阔1*，农绍庄2

1(国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津，300384)2(大连工业大学 食品学院，辽宁 大连，116034)

以鲜活刺参为原料，测定其水分含量、自溶酶和挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)指标在0 ℃冷藏过程中的变化，并采用电子鼻结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术，研究刺参在0 ℃贮藏过程中的挥发性成分变化。结果表明：电子鼻中PCA和LDA算法能够较好的区分不同贮藏时间的刺参样品，且其分析结果与常规的品质指标变化相一致，即贮藏9 d是刺参品质劣变的拐点。经GC-MS共检测出33中挥发性物质，以醇类物质种类最多，含量随贮藏时间的延长呈先增加后降低的趋势；另外还有少量的醛类，其在贮藏6～12 d内含量较高；含氮类物质仅在贮藏9 d和15 d时有少量检出。

刺参；挥发性成分；电子鼻；GC-MS

刺参属于刺参科，仿刺参属，是海参种类中食用品质较高的一种，广泛分布于黄、渤海地区，以山东半岛和辽东半岛地区为主要刺参产区，又称北方刺参[1-2]。其肉质鲜美，营养丰富，富含多糖、皂苷、胶原蛋白等活性成分，具有抗肿瘤、抗凝血、降血脂和防止动脉硬化等多种保健作用，深受消费着青睐[3-4]。随着贮藏时间的延长会发生一系列的气味变化，而气味是影响刺参食用品质的指标之一[5]。因此可从气味分析的角度分析其品质的变化。

电子鼻作为一种新型仿生技术，是通过模拟动物嗅觉系统，收集气味指纹数据来实现对检测对象的品质评价[6]，以其准确度高、重复性好，不存在人的主观臆断特点而优于感官评价；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱连用技术可对挥发性气味进行较为精确的定性和定量分析[7]；顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction，HS-SPME)技术集采样、萃取、浓缩和进样为一体，与GC-MS连用具有较高的实验效率和准确性[8]。目前已有将电子鼻结合GC-MS技术用于果蔬[9]、肉制品[10]、水产品[11-12]、香料香精[13]、烟草茶叶[14]等的气味分析鉴定中。对于刺参类珍稀水产品，还未见关于其挥发性成分的报道。本研究采用电子鼻结合HS-SPME-GC/MS技术对刺参中的挥发性成分进行分析与鉴定，比较了不同贮藏时间下的刺参气味变化。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与处理

鲜活刺参，购买自大连市鑫玉龙海洋珍品有限公司。捕捞后的鲜活刺参立即置于含有海水的冰水混合物的黑色塑料袋中，扎紧后放入白色泡沫盒中，封箱后于当日空运到达国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)，随即将其放入冷却的人工配置的海水盐溶液中，置于0 ℃冷库中贮藏。

1.1.2仪器与设备

Trace DSQ GC/MS气相色谱质谱联用仪,美国Finnigan公司；固相微萃取手柄SPME(含100μm PDMS(聚二甲基硅氧烷)萃取头),美国Supleco公司；PC-420D数字型磁力加热搅拌装置美国Corning公司；PEN3型便携式电子鼻,德国Airsense公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ-82A恒温水浴锅,金坛市金南仪器制造有限公司；ML503千分之一天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2测定指标与方法

1.2.1水分含量

采用GB 5009.3—2010食品安全国家标准 食品中水分的测定中的第一法 直接干燥测定法进行，每组重复测定3次。

1.2.2自溶酶活性

参照夏远景等[15]的方法测定，每组重复测定3次。

1.2.3挥发性盐基氮

依照SC/T 3032—2007水产品中挥发性盐基氮的方法，每组重复测定3次。

1.2.4电子鼻检测方法

将刺参切成1 cm左右的小片，准确称取5 g切碎刺参样品平铺于300 mL烧杯中，用双层保鲜膜密封30 min达平衡状态后开始测量。测试参数：自动调零时间10 s，样品准备时间5 s，样品检测时间50 s，进样流量100 mL/min，清洗时间300 s，每组刺参样品重复测定7次，选取重复性好的4组用于后续电子鼻数据分析。

1.2.5HS-SPME-GC/MS测定方法

刺参试样处理：准确称取3 g搅碎刺参试样于顶空瓶中，加入4 mL饱和食盐水，加盖封口，于50 ℃保温15 min，随后加入磁力搅拌子，立即加盖封口，置于磁力搅拌器上，将老化好的萃取头插到顶空瓶距离样品液面1 cm处，在温度为50 ℃转速为650 r/min条件下吸附40 min后，拔出萃取头，立即插入GC/MS进样口，于250 ℃解吸10 min，每组样品重复测定2次。

1.2.5.1气相色谱条件

规格为30 m×250 μm×0.25 μm的HP-INNOWAX色谱柱；升温程序：40 ℃保留3 min，随后4 ℃/min升至120 ℃，5 ℃/min升至210 ℃，保留5 min；载气为He，流速1 mL/min，不分流。

1.2.5.2质谱条件

电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度200 ℃；连接杆温度280 ℃；母离子m/z 285；激活电压1.5 V；质量扫描范围m/z35～350。

1.3数据处理

用SPSS17.0软件对理化指标进行方差分析和显著性检验；刺参电子鼻传感器数据采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)。对HS-SPME-GC/MS检测获得的实验数据经Xcalibur软件处理、计算机NIST/WILEY库检索、解析和查阅有关资料进行定性分析，对正反匹配度均大于800的检测结果予以确认，并用峰面积归一化法确定各种成分的相对含量。

2　结果与分析

2.1不同贮藏时间下刺参品质变化

随着贮藏时间的延长，刺参在0 ℃下的品质随时间的变化如表1所示。由表1可以看出，刺参的含水量随贮藏时间的延长而呈上升趋势，在0～6 d内刺参的水分含量呈微弱的波动，不同贮藏时间下的含水量无显著性差异；而在贮藏6～9 d时，刺参的含水量显著增加，说明在6～9 d这3 d的时间内刺参可能出现化皮自溶现象，而9～15 d含水量继续缓慢增加，说明刺参的自溶进程在慢慢深入。刚运输回来的鲜活刺参其体内自溶酶活性较高，0～9 d内自溶酶活性呈下降趋势，可能原因是刺参在0 ℃的低温环境中代谢缓慢使得酶活性降低，9～15 d内自溶酶活性又有所上升，这可能是由于刺参的死亡，胞内物质大量溶出，使得自溶酶活力增强。随着刺参贮藏时间的延长TVB-N呈现出明显的增加趋势，刚捕捞的的刺参TVB-N值为5.6 mg/100 g，新鲜度较好，第9天为20.80 mg/100 g，至第15天达28 mg/100 g，说明对照组刺参在第3天后开始发生变化，新鲜度降低，但仍具有食用价值,至第9天其TVB-N的含量已超过20 mg/100 g，已超过GB 2733—2005中规定的牡蛎、淡水鱼虾的规定限量，说明0 ℃环境可以贮藏刺参6～9 d左右，超过9 d已开始出现腐败迹象。综合上述3个指标可以看出，刺参在0 ℃的环境下可贮藏6～9 d，超过9 d刺参的品质已发现显著变化。

表1　不同贮藏时间下刺参的品质变化

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P> 0.05)。

2.2刺参贮藏期间电子鼻检测结果分析

由于刺参在贮藏15 d后从感官上就可以闻到令人恶心的腥臭气味，且气味浓烈，外观呈黏稠状不利于取样和分析，因而不对贮藏15 d的刺参样品进行电子鼻分析。

2.2.1PCA算法对不同贮藏时间下刺参挥发性气味分析

图1为刺参贮藏期间(0～12 d)的PCA分析图。图1中每个椭圆代表同一贮藏时间下的刺参数据采集点,数据点越紧密，代表样品的重复性越好。由图1可以看出，2种主成分的贡献率分别为96.83%和2.88%，之和为99.71%，大于90%，说明这2种主成分基本代表了样品的全部特征信息，无其他干扰成分，因而该PCA分析方法具有可行性。从图1可以看出，各个贮藏时间下的椭圆区域无交叉重叠区域，说明PCA算法可以将不同贮藏时间下的刺参区分开来。

图1　不同贮藏时间下刺参电子鼻PCA分析Fig.1　PCA analysis for sea cucumber at different storage time

2.2.2LDA算法对不同贮藏时间下刺参挥发性气味分析

相比PCA将整组数据整体映射到最方便表示这组数据的坐标系中，LDA算法则利用了数据内部的分类信息，它将数据组间差距最大化，而组内数据差距最小化，注重响应值在空间的分布及距离分析。图2为不同贮藏时间下的刺参的LDA分析图。其判别式LD1和LD2的贡献率分别为84.40%和9.56%，之和为93.96%，大于90%，基本代表了样品的全部特征信息。由图2可以看出，LDA分析可以将不同贮藏时间下的刺参很好的区分开来。另外由各个椭圆距离坐标原点的距离和彼此间的相对距离可以发现，刺参试样随着贮藏时间的延长呈现出明显的规律性变化，表现在0～3 d时，刺参样品沿第一主轴向右、沿第二主轴向上移动明显，且距离原点的位置较远，说明0～3 d内刺参的挥发性气味发生明显变化，可能原因是经过长途运输的刺参在恢复到相对稳定环境中代谢能力增强导致气味变化明显的结果，随后3～12 d内刺参样品在LD1方向上基本保持不变，而沿LD2方向向下移动，其3、6、9和 12 d的刺参样品呈现一定的聚类分布，如3 d和6 d距离较近，说明3 d和6 d的刺参气味差别不大；而9 d和12 d的形成的椭圆距离相对较远，说明9 d和12 d的刺参样品气味存在明显不同，亦即刺参在贮藏9～12 d这3 d的时间内，气味剧烈变化。此外，通过HS-SPME-GC/MS技术对挥发性风味成分进行进一步的分析和鉴定。

图2　不同贮藏时间下刺参电子鼻PCA分析Fig.2　LDA analysis for sea cucumber at different storage time

2.3刺参贮藏期间GC-MS检测结果分析

表2为刺参不同贮藏时期下的主要挥发性成分检测结果。可以看出，在刺参中共检测出33种挥发性成分，主要为醇类、醛类、烃类和少量含氮有机物。

醇类物质种类丰富且相对含量较高为刺参的主要挥发性物质。它可由脂肪酸氧化酶作用于脂肪酸产生或是脂肪氧化分解产生或羰基化合物还原生成，亦或是脂肪酸二级产物氢过物分解产生。在第0、3、6、9、12和15天分别检测出14、14、18、17、16和15种醇类物质，相对含量分别为95.04%、91.17%、54.45%、54.46%、64.7%和89.55%，可以看出随贮藏时间的延长醇类物质的相对含量呈现出先下降随后上升的趋势。

醇类物质通常具有植物香、泥土气味或是酸败气味，实验中检测出的含量较高的醇为2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)环己醇、(Z)-5-癸烯-1-醇、1-辛醇、2-甲基-1-辛醇、1-壬醇、(Z)-4-癸烯-1-醇及(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇，它们也是刺参在不同贮藏时间下存在差异的主要醇类。如2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)环己醇在不同贮藏时间下相对含量差别显著，在鲜刺参中含量为50.05%，到第3天时含量降低为37.8%，当贮藏6d时含量仅为0.17%，在贮藏15d时又有所上升为20.88%；(Z)-5-癸烯-1-醇随贮藏时间的延长呈现先上升后下降趋势，在12 d时达到峰值，相对含量为38.83%。相关研究表明C4～C11的醇类会呈现出金属气味或泥土味，但一般阈值较高，含量较高的醇或是烯醇式结构的醇类阈值一般较低，因而可判断2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)环己醇和(Z)-5-癸烯-1-醇对不同贮藏时间下刺参挥发性风味的区分起了比较大的作用。1-辛醇在不同贮藏时间的刺参内相对含量存在明显差别，在第0、3 、6 、9 、12和15天的刺参样品中的相对含量分别为12.59%、22.96%、16.57%、13.04%、12.88%和19.22%， 1-辛醇具有油脂气味，其会与其他物质作用产生的土腥味。1-壬醇在鲜刺参(0d)中的相对含量仅为0.95%，而在贮藏12 d时增加到2.19%，至15 d含量高达6.16%，随着贮藏时间的延长，其1-壬醇增加显著，同样的2-甲基-1-辛醇和(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇也随贮藏时间的延长而增加，在贮藏15d时相对含量达峰值，因而猜测1-壬醇、2-甲基-1-辛醇和(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇可能是造成贮藏后期刺参产生异味的主要成分。

表2　刺参贮藏期间主要挥发性物质相对含量变化

续表2

化合物名称RT/min相对含量/%0d3d6d9d12d15d小计(3种)0.070.1639.6133.0327.630.32含氮类物质(2-氮杂环)胺(2-aziridinylethyl)amine1.69———0.23—0.1甲氧基苯基肟methoxy-phenyl-oxime27.7———0.93——3-氨基苯乙炔m-aminophenylacetylene41.12—————0.18小计(3种)0001.1600.28总计(33种)97.7496.3398.4596.7797.2795.19

注：“—”表示未检出。

除醇类外在刺参挥发性物质中还有少量醛类检测出来，其阈值一般比醇类低，与其他物质有很强的风味重叠作用[16]。在刺参中检测到辛醛、(Z)-7-癸烯醛和2-(4-甲基-3-环己烯基)丙醛3种醛类物质，其中不同贮藏时间下的刺参中(Z)-7-癸烯醛含量差别较大，贮藏6 d、9 d和12 d的刺参分别有39.5%、32.68%和27.5%的(Z)-7-癸烯醛检出，而其他时间内则未检出。猜测(Z)-7-癸烯醛对不同贮藏时间下刺参挥样品的区分起了比较大的作用。除醇类和醛类外，刺参中还有少量的烃类和含氮物质存在，其中含氮物质仅在9 d和12 d中检测出来，可能与刺参贮藏中后期刺参中蛋白质经微生物的分解作用产生。低级脂肪胺具有令人不愉快的腥臭气味，但在贮藏后期没有检测出尸胺或腐胺，可能是刺参在贮藏15 d时仍没有达到极度腐败状态的结果。

3　结论

刺参在0℃的环境下贮藏，随着贮藏时间的延长水分含量、自溶酶活性以及TVB-N等品质和鲜度指标发生变化的同时，挥发性气味也发生着改变。通过对刺参贮藏期间的水分含量、自溶酶和挥发性盐基氮的3个指标的测定，确定刺参在贮藏9 d后品质开始明显变劣，表现在含水量和TVB-N含量显著增加，自溶酶活性显著降低，即贮藏9 d是刺参品质变化的一个拐点。应用电子鼻对刺参贮藏期间气味进行主成分分析和线性判别分析，发现PCA和LDA分析均能有效的将不同贮藏时间的刺参区分开来，表明随着贮藏时间的延长刺参的气味变化明显。因而利用HS-SPME-GC/MS对刺参贮藏期间的挥发性成分进行分析，共检测出33中挥发性物质，其中以醇类物质种类最多含量最高，是刺参的主要气味成分。不同贮藏阶段的刺参挥发性物质含量差别较大， 醇类物质随贮藏时间的延长呈先增加后降低的趋势；醛类物质在贮藏6 ～12 d内含量显著增加；含氮类物质仅在贮藏9 d和15 d时有少量检出。2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)环己醇、(Z)-5-癸烯-1-醇、1-辛醇、2-甲基-1-辛醇、1-壬醇、(Z)-4-癸烯-1-醇及(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇和(Z)-7-癸烯醛这些挥发性有机物在不同贮藏时期的刺参中差别较大，可能是造成不同贮藏时间下刺参挥发性气味不同的主要成分。

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Analysis of volatiles compounds change of sea cucumber during cold storage by electronic nose combined with GC-MS

ZHANG Peng1, XIAO Shui-shui2, LI Jiang-kuo1*, NONG Shao-zhuang2

1(National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agriculture Products(Tianjin), Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products, Tianjin 300384, China)2(College of Food Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

Changes in water content, autoenzyme and total volatile basic nitrogen (TVB-N) of sea cucumber at 0 ℃ were measured, and changes in the volatile compound profile were also investigated by electronic nose combined with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The results showed that PCA and LDA method of electronic nose could effectively distinguish samples at different storage time, and the results was generally consistent with the results of conventional quality indicators, and the 9th day is the changing point of the quality. Totally 33 volatile components were detected in sea cucumber, including many types of alcohols, The content of alcohols was climbed up and then declined with the storage time prolonged. Additionally,a small number of aldehydes was detected, and their higher values were from 6th-9thday. A small amount of nitrogenous substances were detected on the 9thand 15thday.

sea cucumber; volatile compound; electronic nose; GC-MS

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609035

博士，助理研究员(李江阔副研究员为通讯作者，E-mail:lijkuo@sina.com)。

“十二五”国家科技支撑计划项目(2015BAD￣16B0903)

2016-01-31，改回日期：2016-03-04