梅兰春酒醅中生香酵母的分离鉴定及其发酵面包香气成分分析

王益姝，钱超，黄卫宁*，徐岩，刘若诗，李宁，李志斌，傅贵华

1(江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学，生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)3(南京百合贝克生物科技有限公司，江苏 南京，211000)4(福建省麦都食品发展有限公司，福建 泉州，362213)



梅兰春酒醅中生香酵母的分离鉴定及其发酵面包香气成分分析

王益姝1，钱超2，黄卫宁1*，徐岩2，刘若诗3，李宁3，李志斌4，傅贵华4

1(江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学，生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)3(南京百合贝克生物科技有限公司，江苏 南京，211000)4(福建省麦都食品发展有限公司，福建 泉州，362213)

从梅兰春酒醅中分离筛选生香酵母菌，经26S rDNA D1/D2区域序列分析法鉴定其种属，通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC- MS)分析其发酵液的挥发性香气成分，应用生香酵母发酵面团制作面包，进行感官评定并利用SPME-GC- MS分析面包香气成分。结果表明：分离筛选得到2株产独特香气的酵母菌，两者的发酵液均具有强烈的酒香和酯香风味，分子鉴定结果为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。酯类和醇类是该生香酵母菌发酵液中主体香气成分，乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇和乙醇是其中相对含量较高的四种风味物质，尤其乙酸乙酯相对含量高达50%以上。利用生香酵母发酵面团制作的面包，感官评定得分明显高于普通酵母面包，其面包芯具有淡淡的怡人清香和果香味。与普通酵母面包相比，生香酵母面包中的醇类、酯类等各类风味物质的含量都得到了大幅度提升，尤其是异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯等增加幅度尤为明显。

生香酵母；分离鉴定；发酵；面包烘焙；香气成分

生香酵母，泛指能产生香味物质的酵母菌[1]，其种类较多，目前已报道的能产生显著香气的酵母菌主要包括假丝酵母、毕赤酵母、球拟酵母和汉逊酵母等[2]。不同生香酵母所产生的香味也不尽相同，例如果香、花香、清香、焦糊味和酱香等[2]。因其独特的风味贡献，生香酵母已成功应用于白酒、葡萄酒、食醋、果酒、黄酒、酱油、香精、香料等行业[3-9]，但目前关于生香酵母应用于烘焙食品的研究还鲜有报道。长久以来，国内烘焙行业多是通过添加香精香料以改善面包风味，但香精多为人工合成，长期摄入对人体健康不利[10]。随着人们对健康天然食品的日益青睐，需要寻求更加自然安全的方法赋予面包独特风味。

酒醅是目前分离筛选生香酵母的重要来源之一，已有多位研究者从中分离优质生香酵母用于改善不同香型白酒的风味[11-12]，但鲜有研究者将酒醅中生香酵母应用于其他发酵食品领域。本文选取梅兰春酒醅作为样品，旨在从中分离筛选出优良的生香酵母，分析其发酵液的挥发性香气成分，并将其应用于面团发酵和面包制作，研究生香酵母面包的香气成分，为改善面包风味开辟新思路，为生香酵母在烘焙食品领域的商业化应用进行初步探索。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

梅兰春酒醅(MLC)：由江南大学生物工程学院提供；YPD培养基：杭州百思生物科技公司；真菌DNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；PCR Buffer(+Mg2+)、dNTP、EasyTaq酶、ddH2O：北京全式金生物有限公司；Loading Buffer、DNA Maker：大连 Takara公司；引物：上海桑尼生物科技有限公司；面包粉：鹏泰(秦皇岛)面粉有限公司；即发活性干酵母：广东省梅山马利酵母有限公司；起酥油：中粮东海粮油工业(张家港) 有限公司；白砂糖、食盐：市售。

1.2仪器与设备

HHS-150B型恒温恒湿培养箱，南京恒裕电子仪器厂；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F 洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；XSP-10C 型电子显微镜，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；PC300 型PCR 仪，Eppendorf Master personal；凝胶成像仪，BIO-RAD；DYY-8C 型电泳仪，北京六一仪器厂；搅拌机(SM-25)、醒发箱(SPC-40SP)、烤箱；无锡新麦机械有限公司；57330-U固相微萃取装置及75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取头，美国Supelco公司；GC-MS联用仪，美国Finnigan公司。

1.3方法

1.3.1生香酵母的分离筛选鉴定

1.3.1.1梅兰春酒醅中酵母菌的分离

富集酵母菌：酒醅样品取25 g，加入到含225 mL YPD培养基的锥形瓶中，30 ℃ 200 r/min摇床培养24 h。

酵母菌分离：取上述摇匀的培养液1 mL进行梯度稀释，分别吸取10-4、10-5和10-6梯度的稀释液100 μL涂布于YPD平板，在30 ℃恒温培养箱中培养48 h后挑取典型酵母菌菌落接入YPD液体培养基中，经2～3次划线分离、涂片染色镜检，得酵母菌纯培养物。

1.3.1.2酵母菌的风味筛选

将酵母菌以2%接种量接种于含50 mL YPD液体培养基的锥形瓶中置于200 r/min摇床，另外将其划线接种于YPD平板，平板和液体培养基在30 ℃条件下培养24 h后嗅闻风味(以不接菌的YPD平板和液体培养基为空白)，筛选出产独特香气的酵母菌。观察生香酵母菌的菌落形态以及细胞形态。

1.3.1.326S rDNA D1/D2区域序列分析法鉴定生香酵母菌

利用天根真菌DNA提取试剂盒提取酵母菌的DNA，以DNA基因组为模板，以真菌26S rDNA D1 区通用引物NL1A和LS2为引物，采用50 μL 反应体系进行PCR扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，运用凝胶成像仪进行拍照分析，然后送往上海桑尼公司进行测序，最后将测试得到的扩增序列与NCBI数据库进行BLAST同源性序列比对分析。根据同源序列的比对结果，从GenBank 数据库下载相应模式菌株，利用MEGA5.1软件计算菌株进化距离，运用NJ(Neighbor-Joining)法构建分离出的生香酵母菌的系统发育树。

1.3.2生香酵母发酵液中挥发性香气成分分析

固相微萃取：准确量取5 mL 发酵液于15 mL 顶空瓶中恒温( 60 ℃) 水浴，将50/30 μm DVB /CAR/PDMS 萃取头插入顶空瓶中平衡5 min 后吸附40 min。然后将萃取头移入气相色谱的高温汽化室中解吸8 min，进GC-MS分析，测定生香酵母发酵液中的挥发性香气成分。

GC条件[13]：DB-5MS毛细管色谱柱(60 m×0.32 mm，1 μm)；升温程序：起始温度40 ℃，保留1 min，然后以6 ℃/min升温至160 ℃，接着以10 ℃/min升温至250 ℃，保留10 min。MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；进样孔温度250 ℃；发射电流200 μA；离子源温度200 ℃；采集方式设定为全扫描；质量扫描范围m/z33～495。 通过GC-MS数据分析软件系统完成实验数据的处理，未知化合物经电脑计算机检索，并与NSIT谱库和RTLPEST谱库相匹配，仅报道匹配度大于800( 最大值为1 000) 的物质，并采用峰面积归一化法定量计算出各挥发性香气成分的相对含量。

1.3.3生香酵母发酵面包的感官评定及香气成分分析

将生香酵母接种于YPD液体培养基中活化至稳定期，取菌液5 000 r/min 离心15 min，收集菌体，无菌生理盐水冲洗2次后，接种至小麦粉∶水=1∶3(w/w)的面团中，使得菌种的初始接入量均为106CFU/g，放入30 ℃恒温培养箱中摇床150 r/min培养24 h后进行面包制作，以普通活性干酵母面包为对照组，2种面包具体配方如表1所示，制作步骤参照张思佳等的方法[14]。

表1　面包制作配方

注：-表示未添加，DYB表示活性干酵母发酵制作的面包，WAB表示添加Wickerhamomycesanomalus发酵面团制作的面包。

将酵母菌面团与糖、盐、水、活性干酵母和起酥油投入打面缸搅打成面团，取出覆盖保鲜膜松弛10 min后分割为90 g /个，搓圆整型，于38 ℃相对湿度85%的醒发箱内醒发90 min，上火温度为170 ℃下火温度为210 ℃，烘焙23 min后取出脱模，室温冷却2 h。取面包芯5 g于样品瓶中，运用SPME-GC-MS分析挥发性风味并利用峰面积归一化法计算相对含量，方法同1.3.2。

感官评定小组由30位经过培训的人员(15名女性，15名男性)组成。评定方法采用9分嗜好评分法[13]，对面包的外观、色泽、风味、口感、内部结构以及整体可接受度进行评分。其中1～9分别代表极度不喜欢、非常不喜欢、正常不喜欢、略微不喜欢、不喜欢也不讨厌、略微喜欢、正常喜欢、非常喜欢以及极度喜欢。

1.4数据分析

采用SPSS16.0及Microsoft Office Excel 2013软件进行数据统计分析，运用方差分析法(ANOVA) 进行显著性分析，显著差异水平取P<0.05。

2　结果与讨论

2.1生香酵母的分离筛选

经富集培养，平板涂布，划线分离和涂片镜检，从梅兰春酒醅样品中共分离得到35株酵母菌。通过嗅闻YPD平板和液体发酵液的风味，筛选出2株产特殊香气的酵母菌M-4和M-5，其风味特征如表2所示，菌落形态和细胞形态如图1所示。

表2　生香酵母菌的筛选

注：+++++表示风味极强，++++风味较强，+++风味中等，++风味较弱，+风味极弱。

图1　生香酵母的菌落形态和细胞形态Fig.1　Colony and cell morphology of aroma-producing yeasts

由表2结果发现，M-4和M-5的风味特征一致，固体平板均体现出极强的酯香，发酵液则表现为强烈的酒香和酯香，且M-4发酵液的风味要强于M-5。有文献指出生香酵母原称产酯酵母，酯香是其重要的特征香气[2]。

观察2株菌的菌落形态和细胞形态，发现M-4和M-5的形态完全相同。菌落直径2 mm左右，乳白色不透明，球形凸起，边缘整齐，干燥无光泽，液体培养有菌膜。通过显微镜观察，细胞形态为卵圆形。

2.226S rDNA D1/D2区域序列分析法鉴定生香酵母菌

2株生香酵母菌 26S rDNA D1/D2区序列比对结果如表3所示，菌株M-4、M-5与WickerhamomycesanomalusGU138438.1的同源性分别达到100%和99%。根据NCBI同源性比对结果，构建系统发育树结果如图2所示。

表3　生香酵母菌 26S rDNA D1/D2区序列比对结果

图2　生香酵母菌26S rDNA D1/D2 区序列系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree based on the 26S rDNA D1/D2 gene sequences of aroma-producing yeasts

由图2可知，M-4、M-5WickerhamomycesanomalusGU138438.1有极高的亲缘关系。通过以上结果，可将酵母菌M-4和M-5鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，根据发酵液风味强度，后续选择M-4酵母菌进行分析和应用。

W.anomalus是目前分离得到的常见生香酵母之一。明红梅等[15]从浓香型大曲中成功分离得到产香菌异常威克汉姆酵母。黄光建等[16]从豉香型白酒酒饼中分离获得高产乙酸乙酯的酵母菌J10，鉴定该菌为异常毕赤酵母(与W.anomalus同物异名)。本研究是从食源性样品酒醅中分离筛选得到1株W.anomalus，酒醅主要包含多种谷物粮食，这与面粉基质类似，所以认为W.anomalus用于发酵面团制作面包具有一定的可行性和安全性，而张国华[17]从不同地区的传统面团发酵剂中分离鉴定出异常毕赤酵母(与W.anomalus同物异名)也表明W.anomalus可在面团发酵中应用。

2.3生香酵母发酵液中挥发性香气成分分析

培养基对照组与W.anomalus发酵液的气相色谱图如图3所示，GC-MS的统计结果如表4 所示。结果显示，W.anomalus经发酵产生多种风味物质，主要包括醇类(4种)和酯类(5种)，这两者占风味物质总含量的90%以上，此外还有少量酸类(1种)。各种风味物质的相对含量具有明显差异，经协调作用使W.anomalus发酵液具有独特的酯香和酒香香气。

图3　W. anomalus发酵液中挥发性香气物质GC-MS总离子流色谱图Fig.3　GC-MS total ion current chromatogram of volatile substances from fermentation broth of W. anomalus

保留时间/min风味物质名称峰面积×106相对含量/%3.304乙酸乙酯3169257.0114.118乙醇580410.4394.731乙酸丙酯2580.4655.486乙酸异丁酯6631.1948.174乙酸异戊酯32685.87710.859异戊醇1175921.1516.359乙酸1620.29219.51-壬醇1660.29921.403乙酸-2-苯乙酯1240.22322.463苯乙醇13902.505

W.anomalus发酵液中4种醇类物质分别是乙醇(10.439%)、异戊醇(21.15%)、苯乙醇(2.505%)和1-壬醇(0.299%)，乙醇和异戊醇是发酵液中最主要的2种醇类物质。异戊醇呈现水果香和花香特征[18]，在醇类物质中含量最高，它是白酒中杂醇油的主要成分，是白酒重要的呈香物质之一[19]。苯乙醇具有花香香气，广泛存在于白酒中[18]。

酯类是常见的呈香化合物，大部分表现为水果香和花香[20]。W.anomalus发酵液中检测出的5种酯类物质是乙酸乙酯(57.011%)、乙酸异戊酯(5.877%)、乙酸丙酯(0.465%)、乙酸异丁酯(1.194%)和乙酸-2-苯乙酯(0.223%)。其中乙酸乙酯的相对含量在50%以上，是W.anomalus发酵液中相对含量最高的风味物质，占首要地位。与此相同的是，黄光健等[16]从豉香型白酒酒饼中分离获得的异常毕赤酵母(W.anomalus同物异名)也表现出高产乙酸乙酯的特性。有研究表明乙酸乙酯呈现菠萝香，苹果香，水果香，是中国清香型白酒的主体香气成分[21]。发酵液中另一重要酯类是乙酸异戊酯，它具有香蕉香、甜香和苹果香，其阈值极低具有很高的香气活力[22]，虽含量不高但可能对W.anomalus发酵液的独特风味有较大贡献。与此类似的还有乙酸苯乙酯，其阈值也较低，具有玫瑰花香和蜂蜜香的特征香气[22]。

具体分析W.anomalus发酵液的GC-MS结果发现，酯类和醇类是发酵液中主体香气成分，这两者具有花香和果香的特征香气。乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇和乙醇是其中相对含量较高的4种香气成分，尤其乙酸乙酯相对含量高达50%以上。

2.4生香酵母发酵面包的感官评定结果

如图4所示，生香酵母发酵面团制作的面包WAB在风味和整体可接受度方面要优于普通酵母面包DYB。尤其是在风味评定方面，WAB获得8.5分，明显高于DYB的7.0分，可见对于消费者来说，生香酵母面包的风味更佳。据感官评定者描述，DYB面包芯具有普通面包的风味，且略带感官不佳的酵母味，而WAB面包芯则呈现淡淡的怡人清香和果香味。此外，WAB在外观、色泽、口感方面的评分也略高于DYB。所以就整体感官评定结果而言，WAB面包更受消费者喜爱，其风味更受青睐。

图4　生香酵母面包和普通酵母面包的感官评定雷达图Fig.4　Sensory characteristics of aroma-producing yeast bread and control bread

2.5生香酵母发酵面包的香气成分分析

由表5、表6可知，添加生香酵母发酵的面包(WAB)与普通酵母面包(DYB)的挥发性香气物质的种类和含量有显著差异。普通酵母面包检测出34种风味物质，而生香酵母面包则检测出37种。两种面包的风味物质主要分为醇类、酯类、酸类、醛类、酮类和芳香杂环类，但比较发现，经生香酵母发酵后，面包中的各类风味物质的含量都得到了大幅度提升，酯类、醛类等风味物质的种类也有所增加，这些可能是感官评定结果WAB风味要优于DYB的原因。

表5　生香酵母面包和普通酵母面包的SPME-GC-MS分析

续表5

编号保留时间/min风味物质相对含量/(×106)DYBWAB2516.4651-辛烯-3-醇21.3-2616.576正庚醇24.036.72717.596苯甲醛54.166.92817.822(E)-反式-2-壬烯醛29.225.72917.8872,3-丁二醇27.91053018.164正辛醇4.3516.63118.258异丁酸41.31153218.6121,2-丙二醇12.111.73319.277癸酸乙酯9.01-3419.646异戊酸19.837.93519.854(Z)-顺-3-壬烯-1-醇11.79.253620.2693-甲硫基丙醇-7.203720.554丁酰乳酸丁酯14.111.83821.392(E,E)-反,反-2,4-癸二烯醛-7.883921.449乙酸苯乙酯-13.34021.725正己酸19.639.84122.104苯甲醇9.079.894222.503苯乙醇93.72724322.773γ-辛内酯-6.67

注：-表示未检出。

表6　生香酵母面包和普通酵母面包中挥发性香气物质的统计分析结果

醇类是WAB和DYB中含量最高的风味物质，醇类物质虽然阈值较高，但在面包风味中所占比例也最大，所以是赋予面包香味的重要物质[23]。表6显示醇类物质中乙醇和异戊醇占主导地位，其次是异丁醇、正戊醇和苯乙醇等。而WAB中异戊醇和苯乙醇的含量要远远高于DYB，这可能是由于生香酵母发酵面粉基质后，异戊醇和苯乙醇得到大量积累。异戊醇对面包风味有积极作用，其含量越高则面包风味更受消费者喜爱[24]。苯乙醇可赋予面包愉快的玫瑰香、紫萝兰香、茉莉花香等多种香味[25]。

酯类物质虽含量不高，但因其阈值较低，所以对面包风味具有较大的贡献[23]。WAB中酯类物质的种类和含量明显高于DYB，经生香酵母发酵后的WAB中乙酸乙酯的含量显著提高，尤其还产生了DYB不具有的乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯和γ-辛内酯，由本文2.3可知乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸-2苯乙酯都是W.anomalus发酵液中主要的香气物质。乙酸乙酯的苹果香和香蕉香气对面包风味有益[26]，乙酸异戊酯可赋予面包类似香蕉、梨、苹果的酸甜味[26]，乙酸苯乙酯可使面包具有花香[27]。另外，γ-辛内酯赋予面包蜂蜜、奶酪香气[28]。

酸类可增强面包的滋味和口感[23]，乙酸、异丁酸、异戊酸和正己酸是WAB和DYB中共有的酸类物质，其中乙酸含量最高。WAB中乙酸含量明显高于DYB，本文2.3的结果也显示乙酸是W.anomalus的主要代谢物质之一。

醛酮类和杂芳环类在面包中虽含量较低，但香气贡献能力较强。DYB和WAB中均含有苯甲醛，它具有杏仁香、樱桃香及坚果香[29]。两面包中均检测到杂芳环类物质2-戊基呋喃，主要具有豆香、泥土香及类似蔬菜的香味[30]。

3　结论

(1)从梅兰春酒醅样品中，通过平板涂布分离、风味嗅闻筛选得到2株产独特香气的酵母菌，两株酵母菌的发酵液具有强烈的酒香和酯香风味，经26S rDNA D1/D2区域序列分析法鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。

(2)利用GC-MS测定生香酵母菌发酵液的挥发性香气成分，发现酯类和醇类是发酵液中主体香气成分。乙酸乙酯、异戊醇、乙醇和乙酸异戊酯是其中相对含量较高的四种风味物质，尤其乙酸乙酯相对含量高达50%以上。

(3)生香酵母发酵面团制作面包，其面包芯则具有淡淡的怡人清香和果香味，感官评定得分明显高于普通酵母面包。

(4)GC-MS统计结果显示，与普通酵母面包相比，生香酵母面包中的醇类、酯类等各类风味物质的含量都得到了大幅度提升，酯类、醛类等风味物质的种类也有所增加，尤其是异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯等增加幅度尤为明显，这些都是异常威克汉姆酵母发酵液中主要的香气成分，由此可知生香酵母发酵对面包风味具有显著的改善作用。

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Isolation and identification of aroma-producing yeast from Meilanchun fermented grain and analysis on aroma components of fermented bread

WANG Yi-shu1,QIAN Chao2,HUANG Wei-ning1*,XU Yan2,LIU Ruo-shi3,LI Ning3,LI Zhi-bin4,FU Gui-hua4

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122, China)3(Nanjing Baihobake Biotechnology International Co. Ltd., Nanjing 211000, China)4(Fujian Maidu Food Development Co. Ltd., Quanzhou 362213, China)

Aroma-producing yeasts were isolated from Meilanchun fermented grains, which were identified by 26S rDNA D1/D2 gene sequences analysis. Solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) was used to determined volatile aroma components of fermentation broth. The aroma-producing yeasts were applied in dough fermentation and bread-making. The aroma components of different breads were studied by sensory analysis and SPME-GC-MS. Results showed that two aroma-producing yeasts were selected, whose fermentation liquor had wine and ester aroma. They were identified asWickerhamomycesanomalus. Alcohol and ester were the main aroma components in fermentation broth, including ethyl acetate, isoamyl acetate, isoamylol and ethanol with high relative amounts, 50% high content of ethyl acetate especially. Compared with common yeast bread, bread made with aroma-producing yeast had higher sensory score, whose crumb showed pleasant fresh and fruity aroma. Contents of alcohol and ester in bread made with aroma-producing yeast were highly increased, particularly those of isoamylol, ethyl acetate, isoamyl acetate, phenethyl alcohol and phenethyl acetate.

aroma-producing yeast; isolation and identification; fermentation; bread baking; aroma components

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609008

硕士研究生(黄卫宁教授为通讯作者,E-mail:wnhuang@jiangnan.edu.cn)。

江苏省产学研联合创新基金--前瞻性联合研究项目(BY2014023-16)；国家自然科学基金面上项目(31071595，31571877)；泉州市科技"燎原计划"项目(2015G46)；张家港市科技支撑计划项目(ZKN1301)；苏州市科技支撑计划项目(SNG201401)；中澳国际合作项目(201618)

2016-01-14，改回日期：2016-04-13