石榴分子生物学研究进展

苑兆和

(南京林业大学南方现代林业协同创新中心/南京林业大学林学院，江苏南京 210037)



石榴分子生物学研究进展

苑兆和

(南京林业大学南方现代林业协同创新中心/南京林业大学林学院，江苏南京 210037)

石榴栽培历史悠久，是重要的经济林木，是古老的药用果树。果实富含抗氧化功能物质，临床医用和保健价值高，被誉为超级水果。石榴遗传资源丰富，为育种工作提供大量素材。笔者对石榴的品质发育，包括安石榴苷代谢、花青苷代谢和木质素代谢进行综述，对遗传多样性研究进行评述，并对NGS时代石榴分子生物学研究进行展望。

石榴；安石榴苷；花青苷；木质素；遗传多样性

石榴(Punicagranatum)是千屈菜科(Lythraceae)石榴属(PunicaL.)落叶果树[1]，起源中亚，是古老的保健水果，被誉为超级水果[2,3]。栽培历史悠久。石榴适应性强，在世界范围内广泛栽培，被划为国家规划特色经济林树种之一[4]。石榴果实富含花青苷、黄酮、安石榴苷等多酚类物质，特别是安石榴苷等鞣花单宁类物质临床医用和保健价值高，具有潜在的抗氧化、抗癌、抗菌等功能[5,6]。石榴果皮中，鞣花单宁类物质含量较高。Han等[7]通过高效液相色谱法(HPLC)测定，发现果皮中安石榴苷含量高达4.821mg/g，是果汁中含量的约15倍，籽粒中含量的30倍。随着果实发育成熟，安石榴苷含量逐渐降低，说明其代谢途径中降解能力高于合成能力。对于安石榴苷等鞣花单宁类物质分子代谢通路研究，目前进展缓慢，只克隆到合成前期少数几个基因[8]。石榴果实色泽发育是研究最深入的方向，目前已克隆到完整的花青苷代谢通路基因[8-10]和转录调控基因[11]，并进行拟南芥转化验证，但尚缺乏对籽粒着色研究以及环境因素对MBW复合物调控果实着色影响的研究。籽粒软硬度是重要的经济性状，与木质素代谢相关。张水明等[12]、曹丹琴等[13]分别克隆了石榴籽粒木质素合成途径的关键基因和转录调控因子。石榴耐盐碱能力强，是海滨绿化优良树种。彭媛媛等[14]克隆并验证了石榴耐盐相关基因GPX。对各种性状的研究是为品种改良和育种做铺垫，而收集与评估种质资源是育种的前提。世界各国对石榴种质资源的研究最多，通过分子标记技术评估区域资源遗传多样性[15-19]。本课题组开展石榴全基因组测序项目，将为世界石榴分子遗传学、分子代谢研究、发育生物学研究和生物信息学提供大数据支持，进一步推动石榴分子生物学研究。笔者对石榴品质发育，包括安石榴苷代谢、花青苷代谢和木质素代谢进行综述，对遗传多样性研究进行评述，并对NGS(Next Gegeration Sequencing,二代测序或高通量测序)时代石榴分子生物学研究进行展望。

1　 石榴品质发育研究

1.1安石榴苷分子代谢通路研究

石榴是一种抗氧化能力极强的水果，果实抗氧化剂总浓度11.33mmol/100g，是蓝莓(Vaccinumcorymbosum)的3.11倍，甜橙(Citrussinensis)的9.94倍，苹果(Maluspumila)的39.07倍[20]。石榴抗氧化能力与总酚含量呈极显著正相关(R2 = 0.90，P < 0.01)，其中鞣花单宁类物质含量最高[5]，如安石榴苷(Punicalagins)、石榴皮鞣素(Punicalins)、Gallagic acid具有显著的抗氧化、预防心血管疾病、抗癌、抗菌、抗感染、抗糖尿病等诸多功效，临床医学价值高。在市场消费的水果中，石榴拥有最高浓度的安石榴苷[21]，它是已知分子量最大的酚类物质，可降解为鞣花酸，每个分子内有16个酚式羟基，是抗氧化性最强的酚类物质，也是石榴果实中最主要的酚类物质[2,6]。

安石榴苷是鞣花单宁代谢途径的中间产物，鞣花单宁途径上游与莽草酸途径上游共用[22](图1)。在植物质体中，磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabinoheptulosonic acid-7-phosphate synthase，DAHPS)催化下合成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)。基于序列相似性，DAHPS分为两类：I类包含AroF、AroG、AroH、CM-DAHPS；II类包含芳香氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)结合元件，植物中DAHPS属此类型[22]。I类基因在植物进化过程中缺失[23]。在拟南芥、番茄、土豆和石榴中均分离到DAHPS基因。

3-脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquinic acid synthase，DHQS)用Co2+和NAD+将DAHP合成3-脱氢奎尼酸，然后在3-脱氢奎尼酸脱氢酶(3-dehydroquinic acid dehydratase，DHQD)作用下生成3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimic acid，DHS)[23]。在鞣花单宁途径[24,25]中，DHS 在莽草酸脱氢酶(shikimate dehydrogenase，SD)催化下生成没食子酸。在细胞质中，没食子酸在 UDP 葡糖基转移酶(UDP-glucose:gallate glucosyltransferase，UGT)作用下生成β-葡萄糖没食子鞣苷(β-glucogallin)[26,27]。β-葡萄糖没食子鞣苷在 β-葡萄糖没食子鞣苷O-没食子酰基转移酶(β-glucogallin O-galloyltransferase，GLUG)作用下，生成二没食子酰葡萄糖(digalloylglucose)。二没食子酰葡萄糖在没食子酰基转移酶(Galloyltransferase，GALT)作用下经多次酶促反应，生成五没食子酰葡萄糖(pentagalloylglucose)。五没食子酰葡萄糖在五没食子酰葡萄糖氧化还原酶(Pentagalloylglucose oxygen oxidoreductase，POR)作用下合成鞣花单宁[2]。在石榴安石榴苷分子代谢机制研究中，目前主要集中在部分关键基因的克隆与分析，对UGT基因进行亚细胞定为分析[26]，通过转录组测序技术(RNA-seq)挖掘相关结构基因[8]。

图1　石榴鞣花单宁合成途径简图

1.2花青苷代谢分子机理研究

石榴果实色泽是重要的市场经济性状，表皮颜色主要由花青苷类型与含量决定[11, 28, 29]。花青苷是植物液泡中可溶性色素，依赖pH变化而呈现红色、紫色和蓝色，是果肉[30]、果皮[31]、花[32]、叶[33]中的主要色素。花青苷在果实成熟阶段大量积累，是果实成熟的重要指标[34]，表现为不同颜色，吸引昆虫觅食[35]。另外花青苷可以抵御生物胁迫与非生物胁迫[36]。

花青苷是类黄酮生物合成途径花青苷分支的重要产物之一[37,38]。如图2所示，香豆酰辅酶A在查尔酮合成酶(chalcone synthases，CHS)的作用下合成查尔酮，然后在查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)的作用下合成柚皮素。在类黄酮3羟化酶(flavonoid 3-hydroxylase，F3H)、类黄酮3’羟化酶(flavonoid 3’-hydroxylase，F3’H)和类黄酮3’5’羟化酶(flavonoid 3’5’-hydroxylase，F3’5’H)的催化下合成二氢黄酮醇，在二氢黄酮醇4还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)的作用下合成无色花青素，然后在花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)和无色花青素加双氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX)的作用下合成花青素。在尿苷二磷酸葡萄糖类黄酮糖苷转移酶(UDPG-flavonoid glucosyl transferase，UFGT)的催化下合成花青苷，在氧位甲基转移酶(O-methyltransferase，OMT)的催化下合成氧位甲基化的花青苷[39]。

图2　花青苷代谢途径 (图片引自招雪晴博士学位论文[38] )

在石榴着色基因组学和转录组学研究方面，发现转录调控因子MBW(MYB-BHLH-WD40)复合物是影响果皮着色的主要因子。Ono等[8]首次通过RNA-seq技术在转录组水平构建了石榴花青苷代谢通路。目前已在石榴果皮中克隆到花青苷途径全部结构基因[10,40]和转录调控因子MBW复合物。[11,29]Khaksar等[11]在黑皮石榴中发现PgMYB转录水平与果实色泽度呈正相关，猜测该基因可以提高花青苷积累量。红皮石榴花青素衍生物含量与PgWD40 表达量呈正相关，PgWD40转录水平与PgDFR和PgLDOX表达水平呈正相关，而且这三种基因与PgMYB和PgbHLH表达水平也呈正相关[29]。Rouholamin等[9]通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)验证MBW基因表达水平，发现PgBHLH在白皮和绿皮石榴中表达量最高，在红皮和黑皮石榴中最低；PgMYB在绿皮石榴中累积表达最大，在红皮中最小；PgDFR基因在黑皮石榴中表达量最高，在白皮石榴中表达最低。Ben-Simhon等[41]在白皮石榴中发现PgLDOX基因编码区插入片段导致白皮中无花青苷积累。此外，Harel-Beja等[17]构建了石榴高密度遗传图谱，通过数量性状位点(QTL)技术关联分析果实性状，共得到5个籽粒着色相关位点(aril color 1-1、aril color 1-2、aril color 2-1、aril color 3-1和aril color 5-1)。

在蛋白组学方面，目前发现细胞色素b6-f复合体(sport 0013)、叶绿素 a/b 结合蛋白(sport 5108)和果糖激酶2-like(sport 0503)可能与果皮颜色变化相关；半胱氨酸合酶1(sport 1402)可能对提高石榴的抗氧化胁迫能力起到了重要作用[42]。

1.3木质素分子合成途径研究

石榴籽粒软硬程度是重要的果实品质，软籽石榴价值高，需求量大。籽粒软硬度涉及木质素代谢过程。木质素是储存在特殊细胞细胞壁中的多酚聚合物。植物进化中木质素的出现，与泥盆纪时期(Devonian)维管植物的出现一致。木质素的合成与物种类型、发育时期和细胞类型相关。在不同细胞类型分化中或应对特殊环境变化时，细胞壁出现木质化。木质素在正确时间储存在不同类型细胞中，是植物适应环境和行使功能所必需。种子发育过程中，珠被会分化成由特殊细胞组成的不同细胞层，用于保护种皮或外种皮。种皮细胞发育成木质化次生细胞，以强化外种皮表面。

木质素单体前体是由苯丙氨酸在质体中合成[43](图3)。肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)催化下合成对香豆酸，然后在4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)催化下合成4-香豆酰辅酶A。对羟化肉桂酰基辅酶A：奎尼酸/莽草酸对羟化肉桂酰基辅酶A转移酶(p-hydroxycinnamoyl-CoA:quinate/shikimate p-hydroxycinnamoyltransferase，HCT)催化4-香豆酰辅酶A合成对羟化肉桂酰基奎尼酸/莽草酸。咖啡酰奎尼酸/莽草酸在对香豆酸3-羟化酶(p-coumarate 3-hydroxylase，C3H)催化下由对羟化肉桂酰基奎尼酸/莽草酸合成，然后在HCT催化下合成咖啡酰辅酶A。咖啡酰辅酶A在咖啡酰辅酶A 氧位甲基化转移酶(caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT)催化下合成阿魏酰辅酶A，在肉桂酸辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase，CCR)催化下合成咖啡酰乙醛。咖啡酰乙醛在肉桂酸醇基脱氢酶 (cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)催化下合成咖啡酰乙醇，然后在咖啡酸氧位甲基化转移酶(caffeic acid O-methyltransferase，COMT)催化下合成松柏醇。松柏醇先后在阿胃酸5-羟化酶(ferulate 5-hydroxylase，F5H)和COMT催化下合成芥子醇。松柏醇在尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)催化下合成木质素G单元，芥子醇在UGT催化下合成木质素S单元。

图3　木质素合成途径 (引自Jaime Barros et al.[43])

COMT是木质素途径下游酶，实时荧光定量 PCR 分析表明，PgCOMT在‘红玉石籽’、‘粉皮’、‘会理软籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯软籽’石榴种皮中的相对表达量与石榴籽粒硬度较为一致；随着石榴种皮的发育其表达量先下降后上升[12]。曹丹琴等[13]克隆了石榴种皮木质素合成相关转录因子基因PgMYB，并进行表达分析。

2　遗传多样性研究

2.1分子标记开发与应用

目前在石榴遗传多样性研究中使用的分子标记有：AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms，扩增片段长度多态性)[44-49]、SNP(Single-Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)[17,50]、SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列)[51]、ISSR(Inter Simple Sequence Repeat，简单重复序列间隔)[18]、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增 DNA 多态性)[52]、随机扩增微卫星多态性(Random Amplified Microsatellite Polymorphism，RAMP)[53]、SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism，序列相关扩增多态性)[54]和DNA条形码技术[15]。RAMP适合对遗传背景模糊的物种进行遗传分析。在第二代标记技术中，AFLP相较于其他标记可以扫描全基因组，多态性高、可重复性好，但操作复杂。SNP是第三代分子标记技术，基于PCR扩增和序列测序，探测范围广，多态性更高，操作简单。各种标记技术，在石榴种质资源遗传多样性、遗传图谱等方面应用广泛(表1)。

2.2石榴遗传资源特点

石榴起源中亚，适应性强，分布广。世界石榴遗传多样性丰富，总体分为两大类群。Ophir等[50]使用SNP标记对采自以色列、印度、伊朗、中国、美国、土耳其、西班牙、地中海地区等106个石榴栽培品种进行遗传多样性分析，发现中国、印度和伊朗地区的石榴品种和不可食用观赏石榴Nana聚为G1，其它地区石榴聚为G2。G2组分为2个亚组：G2.1包含Wonderful相关品种，G2.2又分为2个次亚组(G2.2.1和G2.2.2)。起源地中海流域、中亚和卡利福尼亚地区的石榴聚为G2.2.1。G2.2.2可能是杂交群体，如‘早红甜’石榴具有深红色皮和籽、甜度高和软籽粒优良性状。石榴两大组分类也与地区分布相关(图4)。此外，Al-Sadi等的研究也支持地理起源证据。阿曼位于石榴两大中心起源地也门和伊朗之间，是重要的石榴产区。Al-Sadi等[44]运用AFLP标记技术对5个阿曼地区的石榴品种、5个伊朗品种、1个也门品种、1个印度品种、1个黎巴嫩品种和1个西班牙品种进行遗传多样性分析，发现这些品种可能拥有共同起源，在过去国际贸易中引种传播。

图4　世界石榴遗传群体分布图(引自Ophir等[50])

虽然对世界石榴栽培品种遗传多样性研究较多，但对野生群体的研究较少。Singh等[51]使用SSR标记对印度地区51个野生石榴品种和37个栽培品种进行遗传多样性分析，发现栽培群体与喜马拉雅山麓处自然生长的群体亲缘关系更近。该研究补充了世界石榴野生群体与栽培群体间亲缘关系的空白，为石榴育种提供了宝贵的资料。

中国是石榴栽培最多的国家之一，苑兆和研究团队[2]依据石榴产区地理、气候及生态条件，将石榴栽培区划分为山东栽培区、河南栽培区、安徽栽培区、陕西栽培区、四川栽培区、新疆栽培区、云南栽培区和河北栽培区。Yuan等[55]利用荧光标记 AFLP对中国山东、安徽、陕西、河南、云南和新疆 6 个栽培石榴群体的 85 个品种类型进行遗传多样性研究，发现群体间的遗传分化系数为0.2018，群体间的遗传多样性依次为河南群体>新疆群体>陕西群体>安徽群体>山东群体>云南群体。

此外，石榴高密度遗传图谱的建立将为分子辅助育种提供平台。Harel-Beja等[17]通过SNP标记技术构建了首张高密度石榴遗传图谱，并通过QTL技术关联分析果实大小、风味、色泽和籽粒软硬度等果实品质性状。Singh等[51]鉴定了4个与果实重量、酸度、白叶枯病性状的关联标记。

3　展望

NGS时代，基因组和转录组测序技术应用越来越多，石榴分子生物学研究将会达到新的高度。苑兆和研究团队完成了石榴全基因组测序项目，为深入研究石榴功能基因提供大数据支持，将有力推动世界石榴分子生物学研究。

[1]Qin H N, Graham S, Gilbert M G. Flora of China[M]. vol. 13: Science Press, Beijing and Missouri GardenPress, Saint Louis, 2007:274-289.

[2]苑兆和. 中国果树科学与实践·石榴[M]. 西安: 陕西科学技术出版社, 2015.

[3]da Silva J A T, Rana T S, Narzary D, et al. Pomegranate biology and biotechnology: A review[J]. Scientia Horticulturae, 2013, 160:85-107.

[4]国家林业局, 国家发改委, 国家财政部. 全国优势特色经济林发展布局规划(2013-2020年).

[5]Johanningsmeier S D, Harris G K. Annual Review of Food Science and Technology, Vol 2[M]. vol. 2, 2011:181-201.

[6]Seeram N P, Adams L S, Henning S M, et al. In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2005, 16(6):360-367.

[7]Han L L, Yuan Z H, Feng L J, et al. IIIrd IS on Pomegranate and Minor Mediterranean Fruits[M]. vol. 1089, 2015:53-61.

[8]Ono N N, Britton M T, Fass J N, et al. Exploring the Transcriptome Landscape of Pomegranate Fruit Peel for Natural Product Biosynthetic Gene and SSR Marker Discovery[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2011, 53(10):800-813.

[9]Rouholamin S, Zahedi B, Nazarian-Firouzabadi F, et al. Expression analysis of anthocyanin biosynthesis key regulatory genes involved in pomegranate (Punica granatum L.)[J]. Scientia Horticulturae, 2015, 186:84-88.

[10]Zhao X, Yuan Z, Feng L, et al. Cloning and expression of anthocyanin biosynthetic genes in red and white pomegranate[J]. Journal of Plant Research, 2015, 128(4):687-696.

[11]Khaksar G, Tabatabaei S, Ebrahim B, et al. Functional Analysis of a Pomegranate (Punica granatum L.) MYB Transcription Factor Involved in the Regulation of Anthocyanin Biosynthesis[J]. Iranian Journal of Biotechnology, 2015, 13(1):17-25.

[12]张水明,龚凌燕,曹丹琴,等.石榴种皮总木质素含量及 PgCOMT 基因的克隆与表达[J].热带亚热带植物学报, 2015,23(1):65-73.

[13]曹丹琴,杨健,关晓弯,等.石榴种皮木质素合成相关转录因子基因 PgMYB 的克隆与表达[J].西北植物学报, 2015,35(1):23-29.

[14]彭媛媛,龚凌燕,曹丹琴,等.石榴 PgGPX 基因克隆及盐胁迫下的表达分析[J].西北植物学报, 2014,34(9):1735-1741.

[15]Hajiahmadi Z,Talebi M,Sayed-Tabatabaei B E. Studying Genetic Variability of Pomegranate (Punica granatum L.) Based on Chloroplast DNA and Barcode Genes[J].Molecular Biotechnology,2013,55(3):249-259.

[16]Hasnaoui N,Buonamici A,Sebastiani F,et al.Development and characterization of SSR markers for pomegranate (Punica granatum L.) using an enriched library[J].Conservation Genetics Resources,2010,2:283-285.

[17]Harel-Beja R,Sherman A,Rubinstein M,et al. A novel genetic map of pomegranate based on transcript markers enriched with QTLs for fruit quality traits[J].Tree Genetics & Genomes,2015,11(5):e1-e18.

[18]马丽, 侯乐峰, 郝兆祥, 等. 82 个石榴品种遗传多样性的 ISSR 分析[J]. 果树学报, 2015, 32(5):741-750.

[19]赵丽华.石榴 (Punica granatum L.) 种质资源遗传多样性及亲缘关系研究[D].重庆:西南大学,2010.

[20]Halvorsen B L,Holte K,Myhrstad M C W,et al. A systematic screening of total antioxid in dietary plants[J].Journal of Nutrition, 2002,132(3):461-471.

[21]Ismail T,Sestili P,Akhtar S.Pomegranate peel and fruit extracts: A review of potential anti-inflammatory and anti-infective effects[J].Journal of Ethnopharmacology, 2012,143(2):397-405.

[22]Maeda H, Dudareva N. Annual Review of Plant Biology, Vol 63[M]. vol. 63, 2012:73-105.

[23]Tzin V,Galili G.New Insights into the Shikimate and Aromatic Amino Acids Biosynthesis Pathways in Plants[J].Molecular Plant,2010,3(6):956-972.

[24]Vogt T.Phenylpropanoid Biosynthesis[J].Molecular Plant,2010,3(1):2-20.

[25]Ascacio-Valdes J A,Buenrostro-Figueroa J J,Aguilera-Carbo A,et al.Ellagitannins: Biosynthesis,biodegradation and biological properties[J].Journal of Medicinal Plants Research,2011,5(19):4696-4703.

[26]Ono N N,Qin X Q,Wilson A E,et al.Two UGT84 Family Glycosyltransferases Catalyze a Critical Reaction of Hydrolyzable Tannin Biosynthesis in Pomegranate (Punica granatum)[J].PLoS One,2016,11(5).

[27] Grundhofer P,Niemetz R,Schilling G,et al.Biosynthesis and subcellular distribution of hydrolyzable tannins[J].Phytochemistry,2001,57(6):915-927.

[28] Zhao X,Yuan Z,Yin Y,et al.IIIrd IS on Pomegranate and Minor Mediterranean Fruits[M]. vol. 1089, 2015:83-89.

[29]Ben-Simhon Z, Judeinstein S, Nadler-Hassar T, et al. A pomegranate (Punica granatum L.) WD40-repeat gene is a functional homologue of Arabidopsis TTG1 and is involved in the regulation of anthocyanin biosynthesis during pomegranate fruit development[J].Planta,2011,234(5):865-881.

[30]Montefiori M,Espley R V,Stevenson D,et al. Identification and characterisation of F3GT1 and F3GGT1, two glycosyltransferases responsible for anthocyanin biosynthesis in red‐fleshed kiwifruit (Actinidia chinensis)[J].The Plant Journal, 2011,65(1):106-118.

[31]Yang Y-n,Yao G-f,Zheng D,et al. Expression differences of anthocyanin biosynthesis genes reveal regulation patterns for red pear coloration[J]. Plant Cell Reports, 2015, 34(2):189-198.

[32]Chiu L-W,Zhou X,Burke S,et al.The purple cauliflower arises from activation of a MYB transcription factor[J].Plant physiology, 2010, 154(3):1470-1480.

[33]Albert N W, Griffiths A G,Cousins G R,et al.Anthocyanin leaf markings are regulated by a family of R2R3‐MYB genes in the genus Trifolium[J].New Phytologist, 2015, 205(2):882-893.

[34]Jaakola L.New insights into the regulation of anthocyanin biosynthesis in fruits[J].Trends in plant science, 2013,18(9):477-483.

[35]Petroni K,Tonelli C.Recent advances on the regulation of anthocyanin synthesis in reproductive organs[J]. Plant Science, 2011, 181(3):219-229.

[36] Butelli E, Licciardello C,Zhang Y,et al.Retrotransposons control fruit-specific, cold-dependent accumulation of anthocyanins in blood oranges[J].The Plant Cell, 2012, 24(3):1242-1255.

[37]Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynthesis.A colorful model for genetics, biochemistry,cell biology,and biotechnology[J].Plant physiology,2001,126(2):485-493.

[38]招雪晴.石榴果色差异的生理与分子机理研究[D].南京: 南京林业大学,2014,1-109.

[39]Boss P K,Davies C,Robinson S P.Analysis of the expression of anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L.cv Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation[J].Plant physiology,1996,111(4):1059-1066.

[40]招雪晴, 苑兆和, 陶吉寒, 等. 粉花石榴二氢黄酮醇还原酶基因 cDNA 片段的分离及鉴定[J].中国农学通报,2012,28(1):233-236.

[41]Ben-Simhon Z,Judeinstein S,Trainin T,et al.A "White" Anthocyanin-less Pomegranate (Punica granatum L.) Caused by an Insertion in the Coding Region of the Leucoanthocyanidin Dioxygenase (LDOX;ANS) Gene[J].PLoS One,2015,10(11).

[42]曹尚银, 牛娟,曹达,等. 石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质表达的双向电泳分析[J].果树学报,2015,32(6):1062-1069.

[43]Barros J, Serk H, Granlund I,et al.The cell biology of lignification in higher plants[J]. Annals of Botany,2015,115(7):1053-1074.

[44]Al-Sadi A M, Al-Fahdi A R,Al-Yahyai R A,et al. Genetic analysis suggests a shared origin of Punica granatum cultivars in Oman with cultivars from the center of origin, Iran[J].Genetic Resources and Crop Evolution, 2015, 62(6):815-821.

[45]Sarkhosh A,Zamani Z,Fatahi R,et al.A pomegranate (Punica granatum L.) linkage map based on AFLP markers[J].Journal of Horticultural Science & Biotechnology,2012,87(1):1-6.

[46]Nemati Z,Tehranifar A,Farsi M,et al.Evaluation of Genetic Diversity of Iranian Pomegranate Cultivars Using Fruit Morphological Characteristics and AFLP Markers[J].Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 2012, 40(1):261-268.

[47]Ercisli S,Kafkas E,Orhan E,et al.Genetic characterization of pomegranate (Punica granatum L.) genotypes by AFLP markers[J].Biological Research,2011,44(4):345-350.

[48]Moslemi M,Zahravi M,Khaniki G B.Genetic diversity and population genetic structure of pomegranate (Punica granatum L.) in Iran using AFLP markers[J].Scientia Horticulturae,2010,126(4):441-447.

[49]赵丽华,李名扬,王先磊.川滇石榴品种遗传多样性及亲缘关系的 AFLP 分析[J].林业科学,2010, 46(11):168-173.

[50]Ophir R,Sherman A,Rubinstein M,et al.Single-Nucleotide Polymorphism Markers from De-Novo Assembly of the Pomegranate Transcriptome Reveal Germplasm Genetic Diversity[J].PLoS One,2014,9(2):1-12.

[51]Singh N V,Abburi V L,Ramajayam D,et al.Genetic diversity and association mapping of bacterial blight and other horticulturally important traits with microsatellite markers in pomegranate from India[J].Molecular Genetics and Genomics,2015,290(4):1393-1402.

[52]张彦苹,曹尚银,初建青,等.16 份石榴 RAPD 扩增产物的两种电泳方法检测及其序列特征[J].基因组学与应用生物学,2010,29(5):890-896.

[53]Zhao L H,Li M Y,Cai G Z,et al.Assessment of the genetic diversity and genetic relationships of pomegranate (Punica granatum L.) in China using RAMP markers[J].Scientia Horticulturae, 2013,151:63-67.

[54]薛华柏,郭俊英,司鹏等.4个石榴基因型的SRAP鉴定[J].果树学报,2010,4(27):631-635.

[55]Yuan Z,Yin Y,Qu J,et al.Population Genetic Diversity in Chinese Pomegranate (Punica granatum L.) Cultivars Revealed by Fluorescent-AFLP Markers[J].Journal of Genetics and Genomics,2007,34(12):1061-1071.

[56]张四普,汪良驹,吕中伟.石榴叶片 SRAP 体系优化及其在白花芽变鉴定中的应用[J]. 西北植物学报,2010,30(5):911-917.

2016-06-30

国家自然科学基金项目(31272143)；南京林业大学高层次人才科研启动基金(GXL2014070)；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(KYLX16_0857)；南京林业大学优秀博士学位论文创新基金项目; 江苏省高校优势学科建设工程项目(PAPD)。

苑兆和(1963-)，男，山东招远人，教授，博士生导师，研究方向为经济林培育与分子生物学研究。E-mail: zhyuan88@hotmail.com

S665.4

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1002-2910(2016)05-0001-08