烧伤患者体内磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白1水平变化的研究

冯登超，高东东，杨喜明



·论著·

烧伤患者体内磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白1水平变化的研究

冯登超，高东东，杨喜明

目的探讨烧伤患者体内磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)含量水平变化。方法选取2012年12月～2014年12月收治的86例烧伤患者为研究对象，收集烧伤患者自入院治疗至术后治疗10d的血浆，酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆中胰岛素、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和IGFBP-1含量，磷酸化IGFBP-1用Western Blotting检测。结果烧伤患者血浆IGFBP-1含量与总体表面积(TBSA)烧伤指数呈正相关，IGF-1含量随着TBSA值升高而显著下降(P<0.05)。在患者烧伤后72h内，IGF-1含量降低，而IGFBP-1含量[(184±26)ng/mL]升高，相比正常健康组IGFBP-1含量[(16±4)ng/mL]结果有显著统计学意义(P<0.05)，同时血浆中可检测到磷酸化的IGFBP-1。结论烧伤患者血浆IGFBP-1含量变化和IGFBP-1持续的磷酸化与烧伤严重程度相关，IGFBP-1持续的磷酸化可抑制IGF的生物活性，并可作为判断烧伤患者预后的预警指标。

烧伤； 胰岛素； 磷酸化胰岛素样生长因子； 预后

严重烧伤患者死亡的最主要原因是脓毒症和免疫功能失调导致的继发性多器官功能衰竭[1]。该疾病来势凶猛，病情进展快，病死率高，如何及时诊断及有效预防是提高烧伤救治成功率的关键。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)是一类结构上与胰岛素部分同源并具有胰岛素活性的生物多肽，具有免疫调节作用，可作为潜在的调控因子对T淋巴细胞的活性和功能进行调节[2]。胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)由肝脏、子宫和肾脏等组织器官分泌，对分泌细胞本身、邻近的组织细胞以及远端的靶器官均能产生作用，是游离IGF-1生物活性的主要调节因子[2-3]。IGFBP-1的丝氨酸磷酸化能够增加其与IGF-1的亲和力，从而阻断IGF-1与其受体的结合，降低IGF-1的生物学活性[4]。研究表明，血清中持续高水平的IGFBP-1脓毒症及危重症患者预后非常差[5]。而烧伤患者受到应激的影响，血浆内IGF-1水平降低， IGFBP-1水平则显著升高[6]。但磷酸化IGFBP-1水平变化与烧伤患者总体表面积(total body surface area，TBSA)之间的关系尚未见报道,本研究探讨烧伤患者体内IGF-1、IGFBP-1和磷酸化IGFBP-1水平变化与患者TBSA之间的关系，以期为临床判断烧伤患者病情程度的发展及预后提供参考。

资料与方法

1资料来源

选取2012年12月～2014年12月收治的不同烧伤面积和深度患者86例，其中男性60例，女性26例；年龄18～72岁,平均(39.2±21.2)岁。按照烧伤面积将患者划分为4个等级，见表1。其中发生多器官功能不全(MODS)42例。同期随机选择50例在本院体检的健康人员为对照组，其中男性34例，女性16例；年龄18～67岁，平均(38.9±19.9)岁。两组患者基线资料比较无显著性差异。所有患者在纳入研究时均告知其本研究的目的和方法，并签署知情同意书；本研究获得医学伦理委员会批准。

表1　纳入患者的基本资料(按烧伤面积分组)

2观察指标

采集患者烧伤后24h～10d无菌静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空采血管中，所有标本于采集后2h内2 000g/min离心10min，小心转移上层血浆至离心管中分装后于-80℃冰箱中保存。采用酶联免疫吸附(ELISA)技术测定不同伤情烧伤患者血浆中胰岛素、IGF-1和IGFBP-1浓度，试剂盒均购自美国Webster公司。Western Blotting检测烧伤患者血浆中磷酸化的IGFBP-1，检测前不用小牛肠道磷酸酶处理，配制pH<8.3的分离凝胶，将样品经非变性聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳后转膜，洗膜、封闭，然后孵育检测抗体，另一份血浆样品在用50U小牛肠道磷酸酶处理后作为对照验证IGFBP-1的磷酸化。为避免批间差异，标本测定一次完成，并对IGF-1、IGFBP-1以及TBSA进行相关分析。本研究持续时间终点为烧伤患者入院24h～10d或患者死亡。

3统计学分析

结　果

1烧伤患者血浆胰岛素、IGF-1、IGFBP-1以及TBSA相关性分析

烧伤患者血浆内胰岛素含量与TBSA没有相关性(图1a),IGFBP-1水平随烧伤TBSA值升高而升高(P<0.0001)，IGFBP-1水平与烧伤患者TBSA值显著正相关，见图1b。烧伤患者血浆IGF-1水平随烧伤TBSA值升高显著降低(P=0.0083)，IGF-1水平与烧伤患者TBSA值显著负相关，见图1c。这表明烧伤能引起患者早期IGF-1水平的降低，并且和患者TBSA有关。

abc

图1烧伤患者血浆胰岛素、IGF-1、IGFBP-1以及TBSA相关性分析。a.烧伤患者血浆内胰岛素含量与烧伤面积相关性分析;b．IGFBP-1水平与烧伤患者TBSA值相关性分析;c．IGF-1水平与烧伤患者TBSA值相关性分析

2烧伤患者血浆IGF-1和IGFBP-1水平变化纵向追踪分析

烧伤患者血浆IGF-1和IGFBP-1水平变化纵向追踪分析结果见图2。结果显示，在10d的采样期内，只有TBSA 31%～50%(图2c)和TBSA 51%～95%(图2d)的烧伤患者血浆中IGF-1值显著低于正常组(172±58)ng/mL， TBSA 1%～15%烧伤患者在采样期内与正常组相比无显著性差异(图2a)。而TBSA 16%～30%烧伤患者只有在第1天表现出低于正常组。然而对比正常组IGFBP-1(16±4)ng/mL，IGFBP-1在研究期内都表现出显著升高(见图2b)，唯一例外的是TBSA 1%～15%烧伤患者只在烧伤入院后3d才表现出显著增高(见图2a)。TBSA 51%～95%的烧伤患者中有最高的IGFBP-1值(图2d)。这些结果说明患者烧伤后，体内IGF-1水平显著降低，IGFBP-1水平显著升高。

图2烧伤患者血浆IGF-1和IGFBP-1水平变化纵向追踪分析(01=第1天，02=第2天,03=第3天，以此类推)：a.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 1%～15%患者纵向追踪分析；b.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 16%～30%患者纵向追踪分析；c.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 31%～50%患者纵向追踪分析；d.IGF-1和IGFBP-1水平在TBSA 51%～95%患者纵向追踪分析(采用双因素的方差分析进行统计学处理:*P<0.05，**P<0.005)

3IGFBP-1在患者烧伤后表现出持续磷酸化

笔者测出不仅IGF-1和IGFBP-1的水平在患者烧伤后发生了变化，磷酸化IGFBP-1也发生了变化。通过免疫印迹检测IGFBP-1磷酸化表达，结果显示，烧伤患者体内IGFBP-1的确发生了磷酸化修饰，并且IGFBP-1磷酸化表达量随着TBSA的增高而上升。这一结果与ELISA检测结果得到的趋势相似。为了验证IGFBP-1的确发生了磷酸化，笔者将血浆样品与小牛肠道碱性磷酸酶(calf intestinal phosphatase，CIP)共孵育处理，结果显示检测不到磷酸化的IGFBP-1(图3)，说明烧伤患者血浆内IGFBP-1磷酸化增高，并且在纵向观察期限内，始终可观察到IGFBP-1的磷酸化表达。

图3　IGFBP-1在患者烧伤后表现出持续磷酸化

讨　论

本次研究中，笔者探讨了烧伤与IGF-1/IGFBP-1轴功能的关系。在这项回顾性实验研究中，笔者收集了年龄在18～72岁烧伤患者的基本资料，并对患者血浆中IGF-1、IGFBP-1进行监测测定，发现烧伤患者TBSA与血浆中IGF-1、IGFBP-1水平相关。随着烧伤TBSA值的增高，患者血浆中IGF-1与IGFBP-1水平分别降低和增高，并且在烧伤患者入院治疗24h～10d内均能观察到类似变化。笔者推测患者烧伤TBSA可能和IGF-1/IGFBP-1轴功能有关[7]。有报道[8]表明，IGFBP-1的活性在烧伤患者发生改变，笔者也发现烧伤患者IGFBP-1的磷酸化显著升高，而磷酸化的IGFBP-1能够结合游离IGF-1，从而抑制IGF-1的生物活性[9]。这些变化表明，IGFBP-1的磷酸化变化与IGF-1含量降低同时发生，从而导致IGF-1的保护作用降低。IGF-1具有保护机体作用，其含量的增高有助于保护机体避免发生脓毒症，从而提高生存率[8]。

烧伤患者处于一种高代谢状态，机体大量消耗血中葡萄糖，加速蛋白质分解及脂肪的糖异生从而增加血中氨基酸和脂肪酸浓度[1]，此时机体会出现严重的代谢紊乱，导致免疫功能下降从而继发MODS。IGF-1/IGFBP-1轴功能在烧伤患者免疫细胞的激活及功能调节中发挥着保护作用[7-8]。目前认为，烧伤作为一种强烈的应激原，会引起一系列以神经内分泌反应为主的全身非特异性反应[2]。应用血清生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)和IGF-1水平治疗可以提高rhGH和IGF-1水平，但仅用IGF-1治疗并不能有效防止免疫细胞的凋亡[3]。IGFBP-1是人体内重要的内分泌激素之一，对解释许多生理、病理现象及治疗方面有着重要意义[5]。IGFBP-1是一种具有重要生物学意义的多功能蛋白，许多证据表明IGFBP-1在调节糖代方面扮演着重要角色，它可以通过调节IGF-1与受体间的相互作用使血糖升高，也可以直接对血糖代谢产生调节作用[10]。在本项研究中，患者在烧伤后IGFBP-1的磷酸化形式表达增高，而磷酸化的IGFBP-1对IGF-1的亲和力会增强4～6倍[11]。同时，IGFBP-1磷酸化还导致IGFBP-1与细胞表面结合的能力大大下降[11]。而磷酸化的IGFBP-1会抑制IGF-1活性，非磷酸化的IGFBP-1则表现出增强IGF-1活性[12]。患者烧伤后IGFBP-1磷酸化形式的迅速表达，提示IGFBP-1的磷酸化也许是了解烧伤患者体内IGF-1/IGFBP-1轴功能的重要线索。尽管如此，目前对于这一过程中是否有其他特殊的配体参与仍需要后续进行鉴定。基于目前的研究结果，笔者推测磷酸化的IGFBP-1也可能定位细胞表面或细胞外基质对IGF-1进行转运，如果磷酸化的IGFBP-1与IGFBP-3竞争性结合IGF-1，这也许能为烧伤患者IGF-1的免疫治疗提供新思路。此外，发现能控制IGFBP-1磷酸化的激酶也是亟待解决的工作之一。所有这些都为针对IGFBP-1磷酸化的治疗提供了新的理论依据。

综上所述，本组研究结果表明，烧伤患者血浆IGFBP-1与TBSA指数呈正相关，IGF-1与TBSA呈负相关，并且伴随有IGFBP-1的磷酸化表达，这3个指标之间的关系可以作为预警指标从而为大面积烧伤患者的病情评估及诊治提供一定依据。但本研究仍存在一定的局限性，如涉及到IGF-1/IGFBP-1轴功能中其他可能参与的生物活性因子仍不清楚[7]。另外，尽管笔者观察到TBSA与IGF-1/IGFBP-1具有相关关系，但仍不清楚是否由其他因素如年龄、烧伤深度或致病因子导致。笔者也认识到，烧伤患者的激素水平在24h内可能波动较大[13]，为了避免因取样时间带来的误差变化，在每次收集血浆时都尽量同时进行。由于数据的特殊性，患者术后的治愈率以及死亡率在本研究中并未涉及。

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(本文编辑： 郭卫)

Changes of insulin-like growth factor binding protein 1(IGFBP-1)in patients with burn injury

FENG Deng-chao,GAO Dong-dong，YANG Xi-ming

(Department of Burns and Plastic Hand Surgery,Affiliated Hospital of Yan’an University,Yan’an716000,China)

ObjectiveTo investigate the changes of insulin-like growth factor binding protein 1(IGFBP-1) in patients with burn injury. MethodsEighty-six adult patients with burn injury who were admitted in our hospital from Dec.2012 to Dec.2014 were selected as study subjects. Plasma was collected from the date of admission to 10 days after admission. The plasma levels of insulin,insulin-like growth factor-1(IGF-1) and IGFBP-1 were measured by ELISA. Phosphorylated IGFBP-1 was detected by Western Blotting. ResultsThe plasma level of IGFBP-1 was positively correlated with the total body surface area(TBSA). The plasma level of IGF-1 was decreased significantly with the increased degree of TBSA in burn patients. The plasma level of IGF-1 decreased within 72 h after burn injury. However,the mean IGFBP-1 level [(184±26)ng/mL] was significantly higher than that of normal health subjects [(16±4)ng/mL，P<0.05]. The phosphorylated IGFBP-1 could be detected in plasma in patients with burn injury. ConclusionThe changes of IGFBP-1 and persistent phosphorylation of IGFBP-1 in plasma of patients with burn injury are positively correlated with the severity of burn injury. The sustained phosphorylation of IGFBP-1 can inhibit the biological activity of IGF,and can be accepted as a predictor in predicting the prognosis of burn injury.

burns; insulin; phosphorylated insulin-like growth factor; prognosis

1009-4237(2016)09-0545-04

陕西省自然科学基金研究计划资助项目(2014JM4199)

716000 陕西，延安大学附属医院烧伤整形手外科

杨喜明，E-mail:xueningjiangya@126.com

R 644

A

10.3969/j.issn.1009-4237.2016.09.010

2015-10-14；

2016-01-08)