一种检测生物硫醇荧光探针的合成与应用

陈　颂，王　静，侯　鹏，刘　磊，王　鑫

(齐齐哈尔医学院　药学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)



一种检测生物硫醇荧光探针的合成与应用

陈颂*，王静，侯鹏，刘磊，王鑫

(齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

基于硫醇诱导的迈克尔加成反应阻断探针的光诱导电子转移过程(PET)合成了一种基于氟化硼络合二吡咯甲川(Bodipy)类染料的荧光探针，该探针具有高灵敏度和选择性，可在生理条件下检测硫醇。利用核磁和高分辨质谱对探针结构进行了表征。当向探针溶液加入硫醇(0～1 000 μmol/L)时，可在探针溶液的绿色光谱区域引起一个显著的荧光增强响应(增强至150倍)。同时，探针可以检测相对较低浓度的硫醇，对于含有硫醇的氨基酸(半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸)的检出限分别为4.5×10-7，1.2×10-7，2.1×10-7mol/L。此外，相对于其他氨基酸，探针对硫醇具有较高的选择性和灵敏度。该方法成功实现了细胞内硫醇的荧光成像，证明该荧光探针在生物体系中具有潜在的应用能力。

合成;应用;荧光探针;检测;生物硫醇

生物硫醇(如半胱氨酸、同型半胱氨酸和三肽化合物谷胱甘肽)可参与可逆的氧化还原反应过程，调节生化途径中的细胞稳态和细胞代谢，近年来受到了人们极大的关注。半胱氨酸的缺乏会导致各种健康问题，如生长迟缓、毛发色素脱失、嗜睡、肝脏和皮肤组织损伤以及脂肪损失[1-4]。作为最丰富的细胞内的非蛋白硫醇，谷胱甘肽以氧化还原调节器的角色在维持细胞还原环境的过程中发挥着举足轻重的作用，包括保持蛋白质中的半胱氨酸处于还原状态，以及通过捕获易损伤DNA和RNA的自由基保护细胞免受氧化应激影响[5-9]。因此，检测细胞内硫醇的含量对细胞功能的研究具有重要意义。与其他检测技术相比，光学检测是一种操作比较简单的分析方法。其中，荧光分析法由于具有操作简单、检测灵敏以及适于细胞内检测的优势而备受关注[10-12]。

尽管研究人员已设计合成了许多识别硫醇的荧光探针[13-19]，但开发一种高选择性、高灵敏度、同时能够应用于生物成像的荧光探针，仍是广大科研工作者关注的热门课题。氟化硼络合二吡咯甲川(Bodipy)类荧光染料，又名氟硼荧，是一类非常优秀的新型染料，其分子的高度刚性使之具有非常优良的光物理性能，如，较高的摩尔消光系数(ε>80 000 cm-1·M-1)和荧光量子产率(0.6以上)，较好的光稳定性，其光谱不易受溶剂极性、pH值以及激发光降解的影响，确保了其在荧光分析过程中获得的光谱信息完全来源于被测试物[20-22]。本文合成了以Bodipy染料为信号表达基团、硝基烯烃部分作为潜在反应位点的选择性硫醇荧光探针，并将其用于生物体系内硫醇的检测。在探针分子1中，引入硝基烯烃作为光诱导电子转移过程(PET)中电子的受体时，探针的水溶液几乎无荧光，当加入硫醇(RSH)后，硫醇进攻硝基烯烃的双键，进行迈克尔加成反应，导致原有的PET过程被中断，使探针的荧光恢复(图1)。利用反应前后荧光光谱的变化，建立了一种荧光识别硫醇的分析方法。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

Bruker AV400波谱仪(300 MHz)、Bruker microTOF-Q Ⅱ高分辨质谱(美国Bruker公司)，F4600-荧光分光光度计(日本日立公司)，荧光倒置显微镜(日本Nikon Eclipse TE300)。

硝基甲烷、醋酸(国药集团化学试剂有限公司)，哌啶(天津市福晨化学试剂厂)，石油醚(天津市东丽区天大化学试剂厂)，二氯甲烷(天津市凯通化学试剂有限公司)，测试用氨基酸(上海国药试剂有限公司)：半胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，丙氨酸(Ala)，缬氨酸(Val)，苯丙氨酸(Phe)，组氨酸(His)，亮氨酸(Leu)，丝氨酸(Ser)，异亮氨酸(Ile)，色氨酸(Trp)，赖氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)，脯氨酸(Pro)，甘氨酸(Gly)，甲硫氨酸(Met)，酪氨酸(Tyr)，天冬酰胺(Asn)，谷氨酸(Glu)，苏氨酸(Thr)，上述试剂均为分析纯。

1.2探针的合成与表征

在氩气保护下，将化合物2[23](70 mg，0.2 mmol)和硝基甲烷(50 mg，0.8 mmol)溶于10 mL甲苯中，加入哌啶和醋酸各1滴，回流2 h，待反应完成后，降至室温，将反应液倒入水中，以二氯甲烷(3×25 mL)萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离(石油醚∶二氯甲烷=1∶1)得到产品(53 mg，收率 68%)，即为探针分子1。1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ8.03(d，J=13.7 Hz，1H)，7.55(s，3H)，7.39-7.27(m，3H)，6.16(s，1H)，2.71(s，3H)，2.62(s，3H)，1.47(s，3H)，1.42(s，3H)。 HRMS Calcd for:395.162；Found:395.191。

1.3光谱分析测试

称取适量的荧光探针1溶解于乙腈中，配制成1.0×10-3mol/L储备液，4 ℃冷藏保存，测试物经去离子水溶解，配成1.0×10-2mol/L溶液。20 mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4，50% CH3CN)测试体系的配制：将0.003 mL荧光探针1储备液加至1.497 mL乙腈中，再加入0.3 mL被测物质溶液，最后用HEPES缓冲液(pH 7.4)定容至3 mL，混合均匀，测定其光谱。荧光分光光度计参数：λex=506 nm，λem=520 nm，狭缝宽度均为5 nm，电压为700 V，灵敏度为2。

1.4细胞培养与成像

将HeLa细胞放在含有10% 胚胎血清的DMEM培养液中，5% CO2的条件下，37 ℃无菌培养24 h，将其接种至12孔细胞培养板内继续无菌培养过夜，经PBS缓冲液漂洗3次，加入探针1至终浓度为5 μmol/L，孵化30 min，经PBS缓冲液漂洗3次，置于Nikon Eclipse TE300荧光倒置显微镜进行成像。空白对照试验：在相同条件下，向HeLa细胞中预先加入N-甲基马来酰亚胺(1 mmol/L)，37 ℃孵化30 min，经PBS缓冲液漂洗3次，再加入探针1，孵化30 min，经PBS缓冲液漂洗3次，置于荧光显微镜下进行成像。

2　结果与讨论

2.1荧光光谱研究

如图2所示，随着Cys的加入，探针1溶液在520 nm处的荧光显著增强，当加入(1 000 μmol/L)Cys时，荧光强度增强至150倍，在相同的测试条件下，将探针1(1 μmol/L)分别与Hcy和GSH作用均可观察到以上相似的实验结果。通过分析探针1与不同浓度(0～80 μmol/L)生物硫醇反应的荧光发射光谱数据，并对其进行拟合后得到Cys,Hcy,GSH的方程分别为y=41.98+11.19x(r=0.999 7)，y=104.08+43.48x(r=0.998 8)，y=49.13+24.49x(r=0.999 7),式中y为荧光强度，x为生物硫醇浓度(μmol·L-1)。计算得其检出限分别为4.5×10-7，2.1×10-7，1.2×10-7mol/L。在活体细胞中，生物硫醇的含量一般在10-6～10-3mol/L之间，因此，该荧光探针的灵敏度符合细胞水平中硫醇定量检测的要求。

2.2选择性与干扰实验

为了评估探针1对生物硫醇的专一识别能力，本文选取常见的氨基酸、典型的金属离子以及氧化还原剂作为测试物(Cys，Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，Ile，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Asn，Glu，Thr，K+，Na+，Mg2+，Ca2+，Glucose，AA，H2O2，NADH)，测定了不同测试物(200 μmol/L)与探针1(1 μmol/L)混合后的荧光恢复比值。结果显示，探针1对含有巯基的氨基酸(Cys)具有很高的选择性，仅在二者反应后于520 nm处表现出明显的荧光比值增强(R=(IF-IF0)/IF0≈40)，而在生物体系的硫醇检测中，其他测试物的存在对探针溶液的荧光行为均未造成影响(R≈0)。为进一步评估探针1对生物硫醇的高度选择性，在其他测试物存在下，进行了干扰实验的研究。结果表明，除H2O2对探针1识别Cys产生轻微干扰外(R≈33)，其他测试物均不影响探针1对生物硫醇的检测(R≈40)。而且，探针分子溶液对巯基氨基酸具有专一的颜色变化。因此，探针1在模拟的生理状态下对生物硫醇显示出极高的选择性，并能够有效抵抗其他氨基酸的干扰。

2.3pH值的影响

研究表明，人体体液的酸碱度波动范围一般为pH 6.8～7.5，因此，设计在较宽的范围内对生物硫醇具有稳定识别能力的探针将十分符合现实需求。实验考察了pH值对体系荧光强度的影响(见图3)。结果显示在pH 2.0～10.0范围内，探针分子溶液的荧光强度几乎一致，不同的pH值不会使探针的光学性质产生变化，在pH 11.0～12.0范围内，荧光略有增强是由于探针分子在碱性条件下分解。然而，当探针1(1 μmol/L)中加入Cys(200 μmol/L)后，由pH 2.0增至pH 4.0时，溶液的荧光强度随之增强，在pH 5.0～11.0范围内荧光强度相对稳定。考虑到荧光响应最大以及实际应用的可能，本文选择生理pH 7.4 作为研究体系的pH值。

2.4荧光成像

为了实现细胞内生物硫醇的检测，选用人源宫颈癌传代细胞(HeLa)探讨探针1对生物硫醇的荧光成像实验，结果如图4所示。由于肿瘤细胞含有一定量的硫醇氨基酸维持细胞活性，因此将HeLa细胞在探针1中孵育后，通过荧光显微镜可观察到显著的黄色荧光，然而，将HeLa细胞预先用巯基阻断剂N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)处理后，再在探针1中孵育，此时在细胞内只观察到微弱的荧光，说明观察到的黄色荧光是由于细胞内存在的含硫醇物质与探针作用所致。细胞内硫醇荧光成像实验证明，探针1具有检测生物体系内硫醇的可行性。

3　结　论

本文合成了一种Bodipy染料作为荧光母体识别生物硫醇(Cys，Hcy，GSH)的新型荧光探针。相对于其他氨基酸，该探针对含硫醇的氨基酸显示出较高的选择性和专一性。荧光增强主要是由于硫醇进攻硝基烯烃的双键，发生迈克尔加成反应，中断了体系的PET作用。同时，HeLa细胞的荧光成像实验也证明了探针具有检测生物体系内硫醇的能力。

[1]Shahrokhian S.Anal.Chem.，2001，73(24)：5972-5978.

[2]Han Q，Xu M，Tang L，Sun X，Zhang N，Tan X H，Tan X Y，Tan Y，Hoffman R M.Clin.Chem.，2004，50(7)：1229-1231.

[3]Janaky R，Varga V，Hermann A，Saransaari P，Oja S S.Neurochem.Res.，2000，25(9/10)：1397-1405.

[4]Heafield M T，Fearn S，Steventon G B，Waring R H，Williams A C，Sturman S G.Neurosci.Lett.，1990，110(1)：216-220.

[5]Rahman I，MacNee W.FreeRadicalBiol.Med.，2000，28(9)：1405-1420.

[6]Pastore A，Federici G，Bertini E，Piemonte F.Clin.Chim.Acta，2003，333(1)：19-39.

[7]Townsend D M，Tew K D，Tapiero H.Biomed.Pharmacother.，2003，57(3)：145-155.

[8]Cereser C，Guichard J，Drai J，Bannier E，Garcia I，Boget S，Parvaz P，Revol A.J.Chromatogr.B，2001，752(1)：123-132.

[9]Wlodek P J，Iciek M B，Milkowski A，Smolenski O B.Clin.Chim.Acta，2001，304(1)：9-18.

[10]Qin Y A，Zhang X，Liu S Y，Sun M M.J.Instrum.Anal.(秦元安，张献，刘叔尧，孙明明.分析测试学报)，2015，34(10):1158-1162.

[11]Yuan X Y，Wang T L，Guan T T，Wang J L，Huang H W，Yi S J，Tang C R，Zeng Y L.J.Instrum.Anal.(元晓云，王天伦，关婷婷，王金龙，黄昊文，易守军，唐春然，曾云龙.分析测试学报)，2015，34(4):463-467.

[12]Zhang Z，Deng C Q，Guo T，Meng L S.J.Instrum.Anal.(张祯，邓成权，郭添，孟列素.分析测试学报)，2014，33(7):810-814.

[13]Zhao N，Wu Y H，Shi L X，Lin Q P，Chen Z N.DaltonTrans.，2010，39(35)：8288-8295.

[14]Kwon H，Lee K，Kim H J.Chem.Commun.，2011，47(6)：1773-1775.

[15]Screenath K，Yuan Z，Allen J R，Davidson M W，Zhu L.Chem.-Eur.J.，2015，21(2)：867-874.

[16]Long L，Lin W，Chen B，Gao W，Yuan L.Chem.Commun.，2011，47(3)：893-895.

[17]Goswami S，Manna A，Paul S，Das A K，Nandi P K，Maity A K，Saha P.TetrahedronLett.，2014，55(2)：490-494.[18]Zhu L，Yuan Z，Simmons J T，Screenath K.RSCAdv.，2014，4(39)：20398-20440.

[19]Hu M，Fan J，Li H，Song K，Wang S，Cheng G，Peng X.Org.Biomol.Chem.，2011，9(4)：980-983.

[20]Karolin J，Johansson L B A，Strandberg L，Ny T.J.Am.Chem.Soc.，1994，116(17)：7801-7806.

[21]Meltola N J，Soini A E，Hänninen P E.J.Fluoresc.，2004，14(2)：129-138.

[22]Sunahara H，Urano Y，Kojima H，Nagano T.J.Am.Chem.Soc.，2007，129(17)：5597-5604.

[23]Madhu S，Gonnade R，Ravikanth M.J.Org.Chem.，2013，78：5056-5060.

Synthesis of a Fluorescent Probe and Its Application in Thiols Determination

CHEN Song*，WANG Jing，HOU Peng，LIU Lei，WANG Xin

(College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar161006，China)

A bodipy-based fluorescence probe for thiols was developed with high sensitivity and excellent selectivity at a physiological pH(7.4) value.Its structure was characterized by nuclear magnetic resonance(NMR) and high resolution mass spectrometry(HRMS).This probe was designed based on the mechanism that thiols induced the Michael addition reaction to block photo-induced electron transfer process(PET) in this probe.The addition of thiols(0-1 000 μmol/L) to the solution of probe resulted in a remarkable fluorescence enhancement(150-fold) in the green spectra region.Meanwhile，probe was able to detect relatively low concentrations of thiols and the fluorescence detection limit for common amino acids containing thiols，Cys was determined to be 4.5×10-7mol/L.Additionally，similar results were obtained affording 1.2×10-7mol/L and 2.1×10-7mol/L detection limits for GSH and Hcy，respectively.The probe exhibited high selectivity and sensitivity towards thiols over other amino acids.Most importantly，the probe has been successfully utilized for thiols imaging in living cells，which makes it a good candidate for application in biological systems.

synthesis; application; fluorescence probe; determination; biothiols

2016-01-09；

2016-02-06

齐齐哈尔市科学技术计划项目(SFGG-201416)

陈颂，博士，讲师，研究方向：荧光探针的合成与应用，Tel：0452-2663881，E-mail：chensongchemistry@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.021

O657.3;O623.81

A

1004-4957(2016)08-1046-04