3,4-二巯基甲苯衍生化法结合SPME/GC-MS技术分析尿样中超痕量氯乙烯基胂酸

吴姬娜，刘石磊,2*，杨　旸,2，梁龙辉，刘景全,2

(1.防化研究院分析测试中心　北京　102205；2.国民核生化灾害防护国家重点实验室　北京　102205)



3,4-二巯基甲苯衍生化法结合SPME/GC-MS技术分析尿样中超痕量氯乙烯基胂酸

吴姬娜1，刘石磊1,2*，杨旸1,2，梁龙辉1，刘景全1,2

(1.防化研究院分析测试中心北京102205；2.国民核生化灾害防护国家重点实验室北京102205)

选取氯乙烯基胂酸(CVAOA)为生物标志物，建立了路易氏剂染毒尿样中超痕量CVAOA的分析方法。采用正交试验，优化了CVAOA的巯基化衍生方法，选取3,4-二巯基甲苯(DMT)作为衍生试剂，CVAOA与DMT的用量摩尔比为1∶1 000，常温衍生5 min，可达到最高的衍生效率；之后在优化的顶空-固相微萃取(HS-SPME)条件下富集纯化衍生产物CVAOA-DMT；使用气相色谱-质谱/选择离子监测模式(GC-MS/SIM)进行定性定量分析。该方法在50.0 pg/mL～500 ng/mL浓度范围内呈良好的线性(r2=0.998 5)，相对标准偏差(RSD)小于10%，检出限可达7.6 pg/mL，定量下限为23 pg/mL。对低、中、高3种浓度的路易氏剂染毒尿样进行检测，回收率为97.6%～105%，RSD为4.4%～7.1%。该方法分析灵敏度高，具有良好的准确度、精密度和普及性，可被广泛推广和使用。

氯乙烯基胂酸；路易氏剂；尿样；超痕量；固相微萃取(SPME)；气相色谱-质谱(GC-MS)

路易氏剂是一种强糜烂性毒剂[1]。二战期间，日本曾在中国境内使用大量的化学弹药，其中不乏含有路易氏剂的毒气弹[2]。在1997年生效的《禁止化学武器公约》中，路易氏剂被列为附表1中的有毒化学品，成为国际禁止化学武器组织(OPCW)核查的重要监控对象。因此，对于路易氏剂的相关研究一直在持续进行，涉及染毒洗消、涉毒防护、毒剂销毁、毒理机制研究和临床解毒等各方面，而其分析方法作为一种重要技术支撑也备受重视。经过相关研究的开展，环境样品中路易氏剂的分析检测方法已逐步建立，而近年来，对生物样品基质的分析逐渐成为研究焦点[3-9]。随着对生物医学样品分析方法研究的不断深入，各国实验室逐步建立了血样、尿样等生物样品中有机磷毒剂、硫芥类毒剂的分析方法，OPCW已进行5次生物医学样品演练，逐步在各成员国实验室中建立了该两类毒剂的染毒溯源性分析方法[10]，而对路易氏剂染毒生物医学样品的分析工作尚未全面开展。

路易氏剂(L1)的As-Cl键性质十分活泼，遇水可发生水解反应(图1)，生成氯乙烯基亚胂酸(CVAA)，产物可继续发生氧化反应，生成氯乙烯基胂酸(CVAOA)，三者均可与巯基化衍生试剂反应并生成相同的衍生产物[11]。但在染毒生物样品中，游离的路易氏剂含量很低，而CVAA可被氧化，相对而言，CVAOA性质更稳定，且仍具有指证染毒特异性，不存在于未染毒样品中，成为路易氏剂染毒溯源性检测的重要生物标志物。

目前，染毒生物样品中路易氏剂及其相关化合物的分析方法主要有巯基化试剂衍生、气相色谱(GC)或气相色谱-质谱(GC-MS)检测法[3-4,6-7]。本文通过对衍生方法和富集纯化技术的优化，选择3,4-二巯基甲苯(DMT)作为衍生试剂，顶空-固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)检测，建立了特异性强、灵敏度高、适用性好的人尿样中超痕量CVAOA的分析检测方法。该方法可将文献方法[4]的灵敏度提高近1个数量级，且无需复杂的自动化SPME-GC-MS装置，具有更好的普及性。

1　实验部分

1.1试剂与器材

氯乙烯基胂酸(CVAOA)、路易氏剂1(L1)(纯度大于90%，防化研究院提供)；苯基氧化砷(PAO，纯度大于97%，TCI公司)；1,3-二巯基丙烷(PDT，纯度大于97%)、1,2-二巯基乙烷(EDT，纯度大于95%,J&K公司)；2,3-二巯基丙醇(BAL，纯度大于97%，Alfa Aesar公司)；3,4-二巯基甲苯(DMT,纯度大于90%，Sigma公司)；N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA，纯度大于98%，Acros公司)；乙酸乙酯(纯度大于99.9%)，丙酮(纯度大于99.5%)，甲醇(纯度大于99.9%,J&K公司)；无水硫酸钠、盐酸(国产分析纯)；蒸馏水(屈臣氏)；尿样由实验室健康志愿者提供。

Thermo TRACE GC ULTRA气相色谱仪-Thermo DSQ Ⅱ质谱系统；国产水系过滤器(25 mm，0.45 μm，100/pk)；ODS-C18固相萃取柱(500 mg/3 mL,Agilent公司)；聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65 μm)、聚二甲基硅氧烷(PDMS，100 μm)均为Supelco公司产品。

1.2安全措施

路易氏剂是强糜烂性毒剂，使用时要避免毒剂原体的接触性或吸入性中毒。实验过程中，由佩戴防护服的专业人员在通风橱中进行操作。使用后，含有路易氏剂的所有溶液以及器具必须用适当浓度的碱溶液进行彻底清洗消毒。

1.3巯基化衍生与样品制备

1.3.1试剂配制及尿样预处理将PDT,EDT,BAL,DMT配制成1.00 mmol/mL的丙酮溶液；将CVAOA配制成1.00 mg/mL的水溶液；将L1,PAO配制成1.00 mg/mL的丙酮溶液。所配制溶液均于4 ℃保存备用，使用时逐级稀释至所需浓度。

取新鲜采集尿样，过水系过滤器，滤液置于50 mL锥形瓶中，于4 ℃保存备用。

1.3.2巯基化衍生内标溶液：将1.00 mg/mL PAO丙酮溶液逐级稀释至10.0 μg/mL，加入DMT丙酮溶液(摩尔比PAO∶DMT=1∶1 000)，室温衍生5 min，得10.0 μg/mL 的PAO-DMT丙酮溶液，4 ℃保存备用。

取加标尿样1.00 mL，加盐酸调至pH 1.0后，加入DMT(摩尔比CVAOA∶DMT=1∶1 000)，振荡，室温衍生5 min；加5.00 μL 10.0 μg/mL的PAO-DMT丙酮溶液，混匀。

1.3.3富集纯化液相萃取：取1.00 mL衍生尿样，加入3×250 μL乙酸乙酯，振荡萃取10 min，合并乙酸乙酯层，使用无水硫酸钠进行干燥；向萃取液中加入10.0 μL BSTFA，混匀，室温放置10 min；使用柔和的氮气流浓缩萃取液至100 μL，取1.00 μL进行气相色谱-质谱分析。

固相萃取：取1.00 mL衍生尿样，上载到C18固相萃取柱(依次用3.00 mL甲醇、3.00 mL水活化)，然后使用3.00 mL乙酸乙酯洗脱，向洗脱液中加入无水硫酸钠进行干燥，使用柔和的氮气流浓缩洗脱液至100 μL，取1.00 μL进行气相色谱-质谱分析。

固相微萃取：取1.00 mL衍生尿样置于样品瓶中，金属浴加热至90 ℃，使用PDMS纤维，顶空萃取90 min后，置于GC气化室中250 ℃解吸1 min，进行气相色谱-质谱分析。

1.4GC-MS-SIM仪器分析

Agilent DB-17MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱；进样口温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；升温程序：150 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃(5 min)；进样方式：不分流进样；进样量：1.00 μL；载气：高纯氦气，流速1.0 mL/min。离子源温度：250 ℃；EI电子轰击能量：70 eV；溶剂延迟：6 min；选择离子监测(SIM)方法：m/z=229,290(CVAOA-DMT衍生物)，m/z=229,306(PAO-DMT衍生物)；驻留时间：100 ms。

1.5定量工作曲线的绘制

向尿样中添加适量CVAOA水溶液，配制9个浓度的加标尿样基质(20.0 pg/mL，50.0 pg/mL，0.100 ng/mL，0.200 ng/mL，0.500 ng/mL,5.00 ng/mL，50.0 ng/mL，500 ng/mL,5.00 μg/mL)；加入盐酸调至pH 1.0，加入3,4-二巯基甲苯(摩尔比CVAOA∶DMT=1∶1 000)，振荡，室温衍生5 min；加入5.00 μL 10.0 μg/mL PAO-DMT丙酮溶液，混匀；进行SPME-GC-MS(SIM)分析。每个浓度的样品重复测定3次，以目标物(CVAOA-DMT)与内标物(PAO-DMT)的色谱峰面积平均比值为纵坐标，以添加CVAOA浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.6路易氏剂染毒样品的分析

使用适量L1丙酮溶液将尿样染毒至所需浓度，37 ℃孵育2 h。样品制备及仪器分析方法与CVAOA加标尿样相同。

2　结果与讨论

2.1衍生方法的优化

L1及其水解与氧化产物CVAA、CVAOA由于活性、挥发性等原因，不宜直接进行气相色谱分析，通常将其进行巯基化衍生，以改善目标化合物的色谱特征[12]。常用的衍生试剂包括单巯基和二巯基化合物两类，其中二巯基衍生试剂可将L1及其水解、氧化、加合等代谢产物衍生为同一种产物，具有更高的灵敏度[4,7]。鉴于本文是针对尿样中超痕量代谢标志物进行分析，对灵敏度要求更高，因此选择4种二巯基衍生试剂(DMT,EDT,PDT,BAL)对目标物进行衍生。使用正交试验法分别考察了衍生试剂种类与用量、衍生时间、衍生温度4个因素的影响，结果发现：4种二巯基衍生试剂的衍生效率依次为DMT>EDT>PDT>BAL，与常用的PDT[4,7]、BAL[3,6]相比，DMT衍生效率最高，灵敏度更好；在衍生试剂用量方面，通常使用过量巯基化试剂进行衍生，本实验对此进行了量化研究，发现当目标物与衍生试剂的摩尔比为1∶1 000时，衍生效果最佳；在衍生时间和温度方面，由于延长衍生时间以及提高衍生温度并不能有效改善衍生效果，故最终选择的衍生条件为常温下衍生5 min。

2.2内标物的选择与鉴定

L1及CVAA、CVAOA经DMT衍生后可得到相同的环状衍生产物(图2A)，分子离子峰及主要碎片离子归属(m/z)：290(M+·)，229(M+·-·C2H2Cl)，121(C7H5S)+，107(AsS)+。

以该衍生产物(CVAOA-DMT)为分析目标物，选择与之结构及性质相似的PAO-DMT作为内标物质，内标物的GC-MS(EI)全扫质谱结果见图2B。分子离子峰及主要碎片离子归属(m/z)：306(M+·)，229(M+·-·C6H5)，121(C7H5S)+，107(AsS)+。

可见，CVAOA-DMT与PAO-DMT的结构和性质相近，可发生相似的质谱裂解，证明PAO-DMT适合作为CVAOA-DMT定量的内标物质。图2A中碎片m/z229(C7H5S2As)+，121(C7H5S)+,107(AsS)+具有较高的强度，其中m/z229碎片的相对强度最高，特异性好，适宜作为GC-MS(SIM)的监测离子。此外，实验对比发现，当以m/z229,290为GC-MS(SIM)监测离子时，目标物CVAOA-DMT具有最佳的检测灵敏度，样品背景干扰小，故最终确定目标物GC-MS(SIM)方法的监测离子为m/z229,290。同理，选择m/z229,306作为PAO-DMT的GC-MS(SIM)监测离子。

2.3萃取方法的优化

2.3.1萃取方法的比较使用10.0 ng/mL加标尿样，比较了液相萃取、固相萃取、固相微萃取3种萃取方法的富集、纯化效果。结果显示，SPME方法不仅可更加有效去除杂质干扰，净化基质背景，分析灵敏度也明显优于其他两种方法，此外，SPME方法具有无需有机溶剂、操作简便以及基质消耗和损失小等优势[13]。故实验最终选择SPME方法进行萃取。

2.3.2SPME方法的优化在萃取纤维方面，由于聚丙烯酸酯纤维(PA)较聚二甲基硅氧烷纤维(PDMS)更易被破坏，同时PA在使用过程中会产生干扰物共萃取现象，故PA的应用性能不及PDMS[14]，在路易氏剂染毒样品的研究中，不同实验室的工作也陆续印证了这一结论。文献[15-17]对使用的萃取纤维进行了对比优化，证明PDMS具有更好的萃取效率，杂质少且重复性好，更适宜进行生物样品分析。因此，本实验在已有研究基础上，选择对PDMS以及与其涂层相近的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB)两种纤维进行比对研究，结果表明两种纤维萃取时杂质干扰情况相近，而PDMS较PDMS-DVB具有更高的萃取效率，故最终选择萃取纤维为PDMS。

在萃取方式的选择上，相比于浸入萃取法，顶空萃取法的萃取杂质少，更适宜处理油脂、血液、尿样等复杂样品[18]，故文献中均使用顶空-固相微萃取法分析染毒生物样品[4,7]。本实验对顶空和浸入两种萃取方式的富集纯化效果进行了比对，结果表明浸入法在萃取过程中会产生更多的杂质干扰，纯化效果逊于顶空法，且在目标物富集效果方面也无明显改善，而顶空法在相近萃取效率的前提下，具有更加洁净的背景，故最终确定使用顶空方式进行萃取。

在萃取时间和温度的优化实验中发现，随着萃取温度的提高和萃取时间的延长，目标物峰面积逐渐增加，在5～120 min萃取时间范围内未出现吸附平衡。由于SPME方法的重复性不及其他萃取方法，因此未达吸附平衡时进行定量分析会造成方法的精密度不佳。优化实验中需要考虑两方面影响因素，既要使萃取尽可能接近吸附平衡，提高方法的精密度，又要注意分析时间不能过长。基于此，本实验最终选择在90 ℃萃取90 min。结果表明：该条件下，萃取虽未完全达到吸附平衡，但定量分析时的相对标准偏差小于10%，可满足生物样品中超痕量分析检测的要求。

在解吸条件优化中，改变解吸温度(250～270 ℃)对解吸效果无显著影响，解吸时间为1 min时即可实现完全解吸，即使对最高浓度(5.00 μg/mL)的样品进行分析，也未检测到目标物残留，因此最终选择在250 ℃解吸1 min。

2.4GC-MS/SIM定量检测方法的建立

对3个批次9个浓度的CVAOA加标尿样基质(20.0 pg/mL，50.0 pg/mL，0.100 ng/m，0.200 ng/mL，0.500 ng/mL，5.00 ng/mL，50.0 ng/mL，500 ng/mL,5.00 μg/mL)进行SPME/GC-MS(SIM)分析。结果表明，本方法在50.0 pg/mL～500 ng/mL浓度范围内具有良好的线性，回归方程为y=0.121 9x+0.285 7，r2=0.998 5(其中y为目标物与内标物的色谱峰面积平均比值，x为CVAOA的加标浓度，ng/mL)，相对标准偏差(RSD)为5.4%～9.9%。对于20.0 pg/mL加标尿样，可使用所建方法进行分析，色谱峰信噪比S/N>3，证明本方法对样品中超痕量目标物的分析结果良好，满足痕量分析的要求。

2.5方法学评价

2.5.1检出限与定量下限采用标准偏差法[19]，计算检出限(LOD)与定量下限(LOQ)：LOD=3.3×SD/S,LOQ=10×SD/S；其中，SD为接近定量下限浓度的标准偏差；S为标准曲线的斜率。

本文对50.0 pg/mL加标尿样重复测定5次，计算得到CVAOA-DMT与PAO-DMT的色谱峰面积比值的SD=0.000 28，S=0.121 9，根据公式计算得到LOD和LOQ分别为7.6，23 pg/mL。

2.5.2准确度与精密度在空白尿样中分别添加0.025 0，2.50，250 ng/mL的CVAOA，使用所建立的方法进行检测，3种加标浓度下的回收率分别为110%，101%，98.0%，RSD分别为6.3%，4.6%，8.6%。方法的准确度及精密度可满足CVAOA的检测要求。

2.6路易氏剂染毒尿样的分析

配制0.025，2.50,250 ng/mL 3种浓度的路易氏剂染毒尿样，使用本方法进行分析，每个浓度重复测定3次，得到平均回收率分别为105%，97.6%，101%，RSD分别为7.1%，4.4%，5.3%。空白尿样及0.025 ng/mL浓度加标尿样的色谱图见图3，空白样品中在目标化合物±0.1 min位置未出现干扰峰，证明方法具有较好的特异性。通过对路易氏剂染毒样品的分析，表明本方法的分析灵敏度高，准确度与精密度良好，同时具有较好的特异性，可用于实际染毒样品的分析检测。

图3路易氏剂染毒尿样的气相色谱图
Fig.3GC chromatograms of lewisite exposed urine samples A.blank urine sample；B.urine sample spiked with 0.025 ng/mL L1

3　结　论

本文建立了尿样中超痕量氯乙烯基胂酸(CVAOA)检测的GC-MS/SIM分析方法，对衍生、富集纯化方法以及主要分析参数进行了优化，取得了良好的检测灵敏度，方法检出限可达7.6 pg/mL，RSD小于10%。通过提高衍生效率，改善了富集和纯化效果，本方法在缺少自动化SPME/GC-MS设备的前提下，通过使用固相微萃取手柄进行手动操作，实现了尿样中超痕量CVAOA的灵敏检测，并将现有文献报道的分析灵敏度提高了近1个数量级。该方法灵敏度和选择性高，无需特殊的仪器装置，操作简单，可被广泛推广和使用。此外，该方法还可应用于痕量染毒的水样、固体等环境样品的检测，为化学事故救援、反恐化学检测提供了有效手段。

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Determination of Ultra-trace 2-Chlorovinylarsonic Acid in Urine by SPME/GC-MS after Derivatization with 3,4-Dimercaptotoluene

WU Ji-na1,LIU Shi-lei1,2*,YANG Yang1,2,LIANG Long-hui1,LIU Jing-quan1,2

(1.Research Institute of Chemical Defence,Beijing102205，China；2.State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian,Beijing102205，China)

Selecting 2-chlorovinylarsonic acid(CVAOA) as the biomarker,a determination method of ultra-trace CVAOA in human urine specific to lewisite exposure was developed.The conditions for derivatization were optimized by orthogonal experiments,and the results were as follows:thiolation by a 1∶1 000 mole ratio of CVAOA to 3,4-dimercaptotoluene(DMT) for 5 min at room temperature.Enrichment and purification of the derivative product(CVAOA-DMT) based on the optimum headspace-solid phase microextraction(HS-SPME) conditions,and then analysis of the derivative by gas chromatography-mass spectrometry in selective ion monitoring(GC-MS-SIM).The linear calibration range was from 50.0 pg/mL to 500 ng/mL(r2=0.998 5),and the relative standard deviations(RSDs) were less than 10%.The limit of detection was 7.6 pg/mL and the limit of quantitation was 23 pg/mL.The recoveries of lewisite exposed urine samples at the low,middle and high concentration levels ranged from 97.6% to 105% with the RSDs of 4.4%-7.1%.The method exhibited a satisfactory universality with its high sensitivity,precision and accuracy,and could be applied in different laboratories.

2-chlorovinylarsonic acid;lewisite;urine;ultra-trace；solid phase microextraction(SPME);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

2016-01-07；

2016-03-24

刘石磊，博士，研究员，研究方向：军事分析化学，Tel:010-69760259，E-mail:liushilei402@263.net

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.012

O657.63;O611.63

A

1004-4957(2016)08-0999-06