基于 CdSe/ZnS 量子点构建多巴胺荧光检测方法的研究

申晨凡，张直峰，郭瑜桉，闫桂琴

(山西师范大学　生命科学学院，山西　临汾　041000)



基于 CdSe/ZnS 量子点构建多巴胺荧光检测方法的研究

申晨凡，张直峰，郭瑜桉，闫桂琴*

(山西师范大学生命科学学院，山西临汾041000)

以 CdSe/ZnS 量子点为荧光探针，基于多巴胺对 CdSe/ZnS 量子点的荧光猝灭效应，建立了一种可快速测定多巴胺的荧光检测方法。在最优实验条件下(pH 7.4，反应时间20 min)，多巴胺浓度在 0.01～0.7 μmol/L范围内与CdSe/ZnS 量子点的荧光猝灭强度比值呈良好的线性关系(r=0.996)，方法检出限为1.6×10-4μmol/L，相对标准偏差为1.2%。与文献报道的方法相比，该方法的检出限更低，更为灵敏，可用于多巴胺注射液及人体尿样中多巴胺的快速检测。

CdSe/ZnS量子点；多巴胺；荧光；检测

多巴胺(Dopamine，DA)作为哺乳动物中枢神经系统中重要的神经递质，在维持与调节神经系统、心血管系统、肾脏功能以及荷尔蒙的分泌等方面具有重要作用，其在机体内的浓度变化与许多疾病的发生密切相关。体内多巴胺分泌失调是导致神经肌肉失调、精神分裂症、帕金森病、阿尔茨海默氏病等多种精神类疾病发生的重要原因[1-3]。体内多巴胺含量也是临床上精神类疾病检测的重要指标。作为一种心血管药物，多巴胺具有增强心肌收缩、扩张内脏血管、增加肾血流量的功能，常用于心肌梗塞、肾功能衰竭、支气管哮喘以及失血性、心源性及感染性休克的治疗[4]。因多巴胺在机体内的浓度变化直接影响人体的精神活动，在药物注射与服用时不但需要严格控制剂量，而且需要一个准确的定量检测方法。目前,已报道的多巴胺检测方法主要包括毛细管电泳分析法[5]、电化学分析法[6]、比色分析法[7]和流动注射分析法[8]等。其中，荧光检测法由于简单快速且检出限低而受到广泛关注。Zhao 等[9]通过ZnO量子点的发光特性实现了对人血清中多巴胺的检测；Mu 等[10]利用腺苷酸包覆的CdSe/ZnS量子点对多巴胺进行了检测；Liu等[11]构建了3-氨基苯硼酸功能化的 CuInS2量子点作为近红外荧光探针来检测多巴胺。因此，基于荧光检测法的优越性，探索一种简单快速、灵敏且成本低的多巴胺检测方法具有重要意义。

近年来，量子点作为一种新型的半导体纳米发光材料为各种分析物的快速测定提供了可能。与传统的有机染料相比，量子点由于具有量子产率高、光稳定性强、发射波长可调、抗漂白能力强且易于修饰等特性而广泛应用于无机离子、有机小分子以及生物大分子的灵敏检测[12-14]。目前广泛应用的量子点主要有CdTe[15],CdSe[16], CdS[17]等单核型量子点，但单核型量子点存在表面缺陷较多、荧光效率较低、光致氧化的稳定性较差等不足。最近研究显示，在单核型量子点的基础上进一步经量子点包覆形成核壳型量子点后，可有效克服单核型量子点的不足，且光学性能更为稳定，可有效增加对分析物检测的灵敏性[18-19]。

本研究基于多巴胺对水溶性羧基 CdSe/ZnS 量子点荧光的灵敏猝灭特性，建立了一种简单、快速、灵敏且选择性好的多巴胺检测方法，该方法可有效应用于多巴胺注射液与人体尿液中多巴胺浓度的快速测定。

1　实验部分

1.1试剂与仪器

CdSe/ZnS 量子点(荧光量子产率为82%，武汉珈源量子点技术开发有限公司)；多巴胺( 纯度≥98% ，北京百灵威科技有限公司)；盐酸多巴胺注射液(2 mL：20 mg，上海禾丰制药有限公司)；高纯水(18.2 MΩ·cm)采用 WaterPro 水纯化系统(Labconco 公司，美国)制备；其它所用试剂均为分析纯。

CdSe/ZnS 量子点的外观形貌通过 JEM-2100 透射电镜(日本电子,日本)在 200 kV 高速电压下扫描获得：将量子点分散于水中，超声30 min后，取数滴样品分散于铜网上，充分干燥后测定；荧光光谱分析采用 Cary Eclipse 荧光分光光度计(瓦里安公司，美国)进行测定：样品溶液置于四面通石英比色池(1 cm×1 cm)中，激发波长300 nm，扫描范围500 ～700 nm，激发和发射的狭缝宽度均为10 nm；紫外吸收光谱采用 UV-29100 紫外-可见分光光度计(岛津公司，日本)进行测定；溶液pH值采用PHS-3C型pH计(雷磁公司)进行测定。

1.2实验方法

1.2.1测定方法将多巴胺用水配成终浓度为10 μmol/L 的标准样品溶液，在一系列10 mL 比色管中，依次加入0.5 mL 2.0×105μmol/L 磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)、0.01 mL 0.08 μmol/L 的 CdSe/ZnS 量子点溶液和不同浓度的多巴胺标准溶液，用水定容至 5 mL，摇匀，于室温下反应 20 min 后，进行荧光分析。

1.2.2样品分析将多巴胺注射液用水稀释成终浓度为50 μmol/L的母液，采集正常成年人志愿者的尿样，分析前稀释 100 倍，无需做其它预处理。

2　结果与讨论

2.1CdSe/ZnS 量子点的表征

通过高分辨率透射电镜对水溶性 CdSe/ZnS 量子点扫描观测可知，量子点颗粒近似于球型，尺寸均一，总体分散性良好，粒径约为5 nm(图1A)；荧光光谱扫描显示(图1B)，量子点的最大激发波长位于 300 nm 处(曲线a)，而最大发射波长位于 595 nm 处(曲线b)。与文献报道结果基本吻合[20]，说明量子点发光性能良好。

2.2多巴胺浓度对CdSe/ZnS量子点荧光猝灭的影响

为了证实利用CdSe/ZnS量子点测定多巴胺的可行性，分析了多巴胺浓度对量子点荧光强度的影响，从图2可知，多巴胺可有效猝灭CdSe/ZnS量子点的荧光，且猝灭程度随多巴胺浓度的增加而增加(插图)，说明采用CdSe/ZnS量子点测定多巴胺具有一定可行性。

2.3实验条件的优化

基于以上结果，进一步考察了相同pH值条件下2.0×104μmol/L的Tris-HCl与 PBS缓冲液对CdSe/ZnS量子点荧光强度的影响，发现CdSe/ZnS量子点在PBS 缓冲液中具有较强的荧光强度，且多巴胺猝灭CdSe/ZnS量子点荧光强度的效果更明显。因此，实验选择PBS缓冲液为最佳介质。

考察了缓冲液 pH值及浓度对体系荧光强度的影响，结果显示，PBS缓冲液在pH 5.5～6.5时，多巴胺对CdSe/ZnS量子点的荧光猝灭强度随溶液pH值的增加而明显增强，在pH 6.5～8.0之间时，猝灭强度相对稳定，为了便于体液的测定，实验选择pH 7.4 的PBS缓冲液。当缓冲液的浓度在4.0×103～1.6×104μmol/L范围时，随着浓度的增加，体系荧光猝灭强度逐渐增强，在2.0×104～4.0×104μmol/L范围时，猝灭强度相对稳定。因此，选择2.0×104μmol/L pH 7.4的PBS缓冲液进行后续实验。

进一步考察了反应时间对多巴胺猝灭CdSe/ZnS量子点荧光强度的影响。结果表明，在CdSe/ZnS量子点溶液中加入多巴胺，20 min 后反应基本达到平衡，且在后续45 min基本无明显变化。因此，选择在反应 20 min 后进行测定。

实验还考察了盐浓度对多巴胺猝灭CdSe/ZnS量子点荧光强度的影响，发现当NaCl浓度达到3.0×102μmol/L时，多巴胺对CdSe/ZnS量子点的荧光猝灭强度基本保持稳定，说明盐浓度不影响CdSe/ZnS量子点对多巴胺的检测。

2.4多巴胺的检测

在上述优化实验条件下，考察了CdSe/ZnS量子点的荧光强度比值(F0/F)与多巴胺浓度(CDA，μmol/L)之间的线性关系。结果显示，多巴胺在0.01～0.7 μmol/L浓度范围内线性关系良好，回归方程为F0/F=2.51CDA+1.06(其中F0为不含多巴胺时的荧光强度，F为含多巴胺时的荧光强度)，相关系数(r)为0.996，方法的检出限(3σ)为1.6×10-4μmol/L。对含有和不含有多巴胺的体系连续平行检测11次，荧光强度变化的相对标准偏差(RSD)为1.2%。

将该方法与检测多巴胺的其他方法进行对比，结果显示，本方法的检出限更低(见表1)。

表1　不同检测多巴胺方法的比较Table 1　Comparison of different analytical methods for detection of DA

2.5共存物质的影响

考察了多巴胺注射液与生物体液中可能共存的无机离子与有机分子对检测体系的干扰。当多巴胺的浓度为0.1 μmol/L时，考察了500倍的Na+和K+，150倍的Ca2+，300倍的葡萄糖，250倍的蔗糖和谷氨酸，200倍的酪氨酸，150倍的赖氨酸和脯氨酸，25倍的抗坏血酸和尿酸，15倍的甘氨酸对多巴胺测定的影响。结果显示，上述干扰物的加入对多巴胺测定均无明显影响(相对误差<5%)，说明该方法对检测多巴胺具有较好的选择性。

2.6实际样品分析

为了证实该方法在实际应用中的可行性，通过加标回收的方法对多巴胺注射液(0.02～0.04 μmol/L)和人体尿样进行实验。测得其回收率为97.5%～105.0% ，RSD为2.7%～3.3%(表2)，结果满意，说明该方法具有一定的实用价值。

表2　加标回收率实验结果(n=3)Table 2　Results of recovery by standard addition method(n=3)

2.7机理探讨

分析物对量子点荧光猝灭的机制主要是通过共振能量转移(FRET)[23]、电子转移(ET)[24]以及表面吸附分子对量子点表面态能级的改变来改变体系的发光[25]。其中FRET和ET是两种常见的信号传导模式。对多巴胺紫外可见吸收光谱和CdSe/ZnS量子点发射光谱的分析显示(图3A)，多巴胺的紫外可见吸收光谱和CdSe/ZnS量子点的发射光谱无重叠，说明多巴胺与量子点之间不存在FRET的可能性，因此，FRET作为多巴胺猝灭CdSe/ZnS量子点荧光的机制可被排除。

对CdSe/ZnS量子点、多巴胺和CdSe/ZnS量子点-DA的紫外吸收光谱进行分析，发现多巴胺和CdSe/ZnS量子点在200～350 nm波长范围内均无明显吸收峰(图3B曲线a和c)。当加入量子点后，多巴胺的吸收光谱位置(280 nm处)和强度未发生明显变化(图3B曲线b)，因此多巴胺猝灭CdSe/ZnS量子点的荧光并非由于光谱的内过滤效应所致。从荧光光谱图(图2)也可看出，随着多巴胺浓度的增加，CdSe/ZnS量子点的荧光光谱未出现明显的红移或蓝移，表明加入多巴胺不会导致CdSe/ZnS量子点发生团聚或尺寸减小[26]。因此，可排除基于表面相互作用所引起CdSe/ZnS量子点团聚或尺寸减小而导致荧光猝灭。

根据文献报道，儿茶酚胺[27-28]与量子点发生相互作用后，由于儿茶酚胺具有邻苯二酚结构，该结构极易在碱性环境中氧化为苯醌，氧化苯醌可作为电子受体使量子点的荧光猝灭。多巴胺为儿茶酚胺类神经递质，结构上具有邻苯二酚结构，且易在碱性环境中氧化为多巴醌。因此，推断多巴胺猝灭CdSe/ZnS量子点的荧光机理可能为：在CdSe/ZnS量子点溶液中加入多巴胺后，多巴胺被氧化为多巴醌，多巴醌与CdSe/ZnS量子点表面修饰的羧基发生氢键作用后作为电子受体使CdSe/ZnS量子点的荧光猝灭(如图4)。

3　结　论

本文基于多巴胺与水溶性羧基CdSe/ZnS量子点之间的电子转移荧光猝灭效应，建立了一种快速检测多巴胺的荧光分析方法。该方法可在0.01 ～0.7 μmol/L浓度范围内实现多巴胺的有效检测，检出限为1.6×10-4μmol/L，方法具有灵敏、简单、成本低且选择性好的优点，可用于多巴胺注射液及人体尿样中多巴胺的快速检测。

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Research on Development of Dopamine Fluorescence Detection Method Based on CdSe/ZnS Quantum Dots

SHEN Chen-fan,ZHANG Zhi-feng,GUO Yu-an,YAN Gui-qin*

( College of Life Science,Shanxi Normal University,Linfen041000,China )

By taking CdSe/ZnS quantum dots as a fluorescence probe,a method for the rapid detection of fluorescence of dopamine was developed based on fluorescence quenching effect of dopamine to CdSe/ZnS quantum dots.Under the optimal experimental conditions(pH 7.4,reaction time:20 min),the fluorescence quenching strength ratio of CdSe/ZnS quantum dots had a good linear relationship(r=0.996) with concentration of dopamine in the range of 0.01-0.7 μmol/L.The detection limit was 1.6×10-4μmol/L,and the relative standard deviation of this method was 1.2%.Compared with some approaches reported in current literatures,this method has a lower detection limit and higher sensitivity.The method could be applied in the rapid detection of dopamine injection and dopamine in human's urine sample.Key words：CdSe/ZnS quantum dots;dopamine;fluorescence;detection

2016-03-12；

2016-05-11

山西省重点化学优势学科建设项目(912019)；国家教育部博士点联合基金项目(20111404110002)

闫桂琴，教授，研究方向：植物分子生物学及生物分子化学，Tel：0357-2051867,E-mail：gqyan2013@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.004

O657.3；O623.732

A

1004-4957(2016)08-0949-06